印迹基因tssc3在骨肉瘤干细胞中的作用及分子机制研究

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1、第三军医大学博士学位论文印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中的作用及分子机制研究姓名：郭乔楠申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：黄玉胜201205第三军医大学博士学位论文印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中的作用及分子机制研究幸摘要骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是常见的骨的恶性肿瘤，好发于青少年，其发病率占恶性骨肿瘤总数的20％，占儿童肿瘤总数的5％。骨肉瘤恶性程度高，早期即可发生广泛的肺转移，约20％的骨肉瘤患者发生可被影像学方法检测的肺转移，而80％的骨肉瘤患者在单纯手术切除后发生转移。肺转移引起的呼吸衰竭是导致骨肉瘤死亡的常见原因。研究

2、发现许多致病因素如化学因素、放射性物质、病毒感染等均能诱导骨肉瘤的发生。同时在骨肉瘤的发生发展过程中，伴随着一系列的基因和表观遗传学的改变，但这一系列的改变不具有一致性。因而目前的观点认为，骨肉瘤的发生是一个多阶段演进和多基因参与的过程，但确切的发病机制尚未阐明。随着肿瘤病因学研究的深入，发现肿瘤不仅是一种遗传有关的疾病，同时也是一种表遗传性疾病，几乎所有的肿瘤中都有表观遗传的异常。其中印迹基因作为一种表遗传学机制，以原癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生及演进，备受关注。近年来，随着干细胞研究的不断深入以及肿瘤干细胞理论的提出，越来越多的证据显示肿瘤是由其内部的一小部

3、分细胞所始动和维持的，这一小部分细胞被称作肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)。和普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞不仅具有自我更新和多向分化潜能，同时还具有诱导肿瘤形成的能力。自1994年Lapidot在白血病细胞中通过特异性细胞表面标志分离出具有自我更新和维持其恶性能力的急性粒细胞性白血病干细胞以来，研究者们陆续从脑肿瘤、乳腺癌、消化道肿瘤、恶性黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等分离得到了肿瘤干细胞。在间叶性肿瘤中，Gibbs等报道在骨肉瘤中存在一小部分具有自我更新能力，并能在无血清悬浮培养条件下形成肿瘤细胞球的细胞，这部分细胞高表达STAT3和多潜能干细

4、胞标记Oct3／4、Nanog，从而显示出干细胞样的特性。该研究将肿瘤干细胞学说扩展到了间叶来源的肿瘤，证实了肉瘤中肿瘤干细胞的存在。随后陆续有多个实验室以不同的方法证实了骨肉瘤肿瘤干细胞的存在。骨肉瘤干细胞为治愈骨肉瘤提供了可能，但也带来了一系列难题，由于骨肉瘤干细胞的放化疗抵抗和高转移特性，使得目前的治疗+本课题受国家重点基础研究计划(973计划，No．2010CB529402)、重庆市自然科学基金重点项El(CSTC，2009BA5009)和国家自然科学基金资助(No．30971139)8第三军医大学博士学位论文———————————————————————

5、———————————————————————————————————————一手段都不能根治肿瘤。寻找可行的治疗手段是目前面临的关键问题。我们课题组在前期研究中发现印迹基因TSSC3(tumor．suppressingSTFcDNA3)与骨肉瘤的发生发展及抗失巢凋亡能力有关。TSSC3基因，又名脱基因(imprintedinplacentaandliver)，定位于染色体1lpl5的胚胎肿瘤抑制区，属PHLDA基因超家族，呈母系等位基因表达，与TDAG51(Tcelldeathassociatedgene51)高度同源，并含有与凋亡相关的PQ蛋白基序，推测TSS

6、C3印迹基因在细胞凋亡中发挥作用。我们前期研究发现骨肉瘤细胞系SaOS2中TSSC3基因启动子区CG位点的平均甲基化率高，用去甲基化药物处理该细胞后TSSC3表达明显增高，且细胞凋亡率也显著增加。利用载体稳定高表达TSSC3，发现高表达TSSC3在体外能抑制骨肉瘤细胞增殖，在体内能抑制肿瘤生长，并通过线粒体途径诱导骨肉瘤细胞凋亡和增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。但TSSC3在作为肿瘤起始细胞的肿瘤干细胞中的作用尚待研究。为了研究TSSC3在骨肉瘤干细胞中的作用及可能的分子机制，我们拟首先利用不同方法从MG63、SaOS2和恶性转化的人成骨细胞hFOBl．19(M

7、ThFOBl．19)中分离鉴定出肿瘤干细胞，并检测印迹基因TSSC3在干细胞中的表达，然后利用不同载体上调或下调骨肉瘤细胞中TSSC3的表达，最后检测差异表达TSSC3对骨肉瘤干细胞干性和凋亡的影响及其作用机制。有鉴于此，本研究分三部分进行：第一部分拟通过肿瘤干细胞成球培养和基于骨肉瘤干细胞表面标记(CDl33、CDll7、Stro．1)的流式细胞仪分选方法从MG63、SaOS2和恶性转化的人成骨细胞hFOBl．19(MThFOBl．19)中分离鉴定骨肉瘤干细胞。并根据MThFOBl．19细胞的高克隆形成特性，利用连续克隆形成和成瘤实验从该细胞中分离出肿瘤干细胞，

8、并对其自我