凋亡通路机制在肺癌和骨肉瘤辐射抗性中的作用研究

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1、凋亡通路机制在肺癌和骨肉瘤辐射抗性中的作用研究Studyontheroleofapoptosispathwayintheradiationresistanceoflungcancerandosteosarcoma作者姓名：赵冯均领域（方向）：外科学指导教师：单玉兴教授类别：临床医学硕士答辩日期：2015年5月28日前言细胞凋亡是细胞在某些因素的作用下发生的一种程序性细胞死亡，与细胞直接死亡的区别是不会引发炎症反应。该过程对于维持机体正常的生理环境非常重要，凋亡也参与机体的病理过程，如癌细胞的死亡。目前恶性肿瘤的主要治疗方法包括手术治疗、放射治疗、化学治疗及生物治疗。肿瘤的化学治疗因其方案

2、不同，疗效也不同，但因药物可到达全身，产生的全身副作用亦较大；而放射治疗因其直接作用于肿瘤局部，仅对肿瘤附近正常组织产生副作用，弥补了化疗药物全身副反应的缺陷，但射线有其本身的局限性，即因各种恶性肿瘤对射线的敏感性不同，其剂量率及总剂量需根据肿瘤类别制定最佳的治疗方案。据不完全统计，世界上约70%左右的恶性肿瘤患者在接受放射治疗，约40%的恶性肿瘤可用放射治疗根治。对于放射敏感性较低的肿瘤（如腺细胞发生的恶性肿瘤）及不敏感的肿瘤（如纤维组织发生的恶性肿瘤），其主要的治疗方式仍以手术治疗及化疗为主。目前关于肿瘤细胞放射敏感性的报道较多，包括各种凋亡通路及细胞内成分的破坏、细胞内修复系统的紊

3、乱等，但肿瘤细胞辐射抗性及其凋亡机制的研究，目前尚未见报道。本研究基于上述问题，利用辐射敏感性不同的非小细胞肺癌细胞系（辐射抗性的A549和辐射敏感的H460）和辐射不敏感的骨肉瘤细胞系（HOS），检测内源性和外源性凋亡通路相关分子的转录水平和蛋白水平的变化；体外建立shNRP1-A549模型，进一步比较敲低辐射抗性基因——NRP1的A549细胞与亲本A549细胞受照后凋亡通路相关分子的表达变化，阐明辐射抗性肿瘤细胞的凋亡机制，为临床肿瘤放疗方案的优化提供理论依据。I中文摘要凋亡通路机制在肺癌和骨肉瘤辐射抗性中的作用研究放射治疗是治疗恶性肿瘤的有效手段之一，电离辐射可直接杀死肿瘤细胞，或

4、诱导其凋亡及自噬的发生。凋亡是细胞受到外界因素作用后发生的一种程序性细胞死亡，国内外学者对细胞凋亡的研究较多且较为深入。凋亡过程涉及多种通路，包括内源性凋亡通路（即线粒体凋亡通路），外源性凋亡通路（即死亡配体/受体通路），内质网通路及自噬等，各通路之间可互相影响，如外源性及内源性通路间可相互交叉，进而放大凋亡效应。目前，对恶性肿瘤的研究多集中在药物对肿瘤细胞的作用或肿瘤细胞的辐射增敏剂作用，而关于不同辐射敏感性的肿瘤细胞，特别是具有辐射抗性的恶性肿瘤凋亡机制的研究较少。本研究旨在探索辐射抗性肿瘤细胞凋亡通路的分子机制，为提高肿瘤放疗疗效提供理论依据。研究目的：观察辐射作用后的肺癌和骨肉瘤

5、细胞凋亡通路相关分子的表达变化，阐明辐射抗性肿瘤细胞的凋亡机制。研究方法：选取非小细胞肺癌细胞系（辐射抗性的A549和辐射敏感的H460）和骨肉瘤细胞系（HOS）进行实验，并利用逆转录病毒转染方法建立shNRP1-A549稳定表达细胞模型，采用流式细胞术检测电离辐射作用后肿瘤细胞的凋亡率及周期进程，进一步应用qRT-PCR及Westernblot法检测细胞凋亡相关分子的mRNA及其蛋白水平变化，探讨凋亡通路在辐射抗性肿瘤细胞中的作用机制。研究结果：1.辐射抗性肿瘤细胞受照后凋亡率和细胞周期进程的变化10GyX射线照射后A549、H460、HOS及shNRP1-A549细胞与假照组相比凋亡

6、率均增加，辐射敏感的H460细胞及shNRP1-A549细胞凋亡率明显高于A549和HOS细胞，说明A549和HOS细胞具有较高的辐射抗性。细胞周期进程的结果显示，A549和shNRP1-A549细胞受照后G2/M期比例较假照组升高，且shNRP1-A549细胞的升高变化较亲本A549细胞更明显，说明干扰NRP1基因表II达后，出现明显的G2/M期阻滞，增强对辐射的敏感性。2.辐射抗性肿瘤细胞中内源性凋亡通路相关分子转录及蛋白水平变化10GyX射线作用后，A549细胞Caspase-9基因转录水平高于假照组，HOS细胞却有所下降但变化不显著，而shNRP1-A549和H460细胞Casp

7、ase-9基因转录水平显著高于假照组。促凋亡基因Bax转录水平在受照后的A549及H460细胞中均升高，但具有辐射抗性的A549细胞中升高幅度只是假照组的2-3倍，HOS细胞中的转录水平低于假照组，而在H460细胞中升高幅度达到假照组的35倍。抗凋亡基因Bcl-xL转录水平在辐射抗性A549及HOS细胞中升高，而在辐射敏感的H460细胞中无明显变化。本实验结果表明，电离辐射可通过激活辐射抗性肿瘤细胞的内源性凋亡通路，但其凋亡通路中的