iaspp在p53家族凋亡通路中的作用及机制研究

《iaspp在p53家族凋亡通路中的作用及机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第三军医大学博士学位论文iASPP在p53家族凋亡通路中的作用及机制研究姓名：蔡云申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：刘泽军201205第三军医大学博士学位论文iASPP在p53家族凋亡通路中的作用及机制研究摘要背景p53蛋白是近三十年来发现的最重要的抑癌蛋白之一。p53家族有三个成员组成，分别是p53，p63，andp73．这三个成员在结构和功能上的具有高度一致性，但分别又具有其独特的生物学功能。相比较p53而言，p63和p73主要在细胞的正常发展中起重要作用，而p53则主要是阻止肿瘤细胞的生长。这些年的研究主要集中与p53作用的蛋白上，而对于p63和p73的研究还相对较少。AS

2、PP(apoptosisstimulatingproteinofp53)是近几年新发现的蛋白质家族，由三个成员组成，分别是ASPPI、ASPP2、iASPP。该家族结构的共同特点是：它们都有SH3结构域、大量的锚蛋白重复、丰富的脯氨酸结构域。ASPPl、ASPP2功能是选择性的激活p53／p63／p73的转录功能，促进凋亡基因启动予的活化，增强p53的促进细胞凋亡功能。相比之下，iASPP是p53的抑制子，通过与ASPPl和ASPP2竞争与P53结合，从而抑I告IJP53的抑癌功能。iASPP抑制细胞凋亡的机制是通过抑I书lJp53对凋亡基因的启动子的转录活性而抑制细胞凋亡的。但是p53功能丧

3、失的情况下iASPP在是如何影响细胞凋亡的仍然还不清楚。为了阐明不同类型p53的肿瘤细胞中iASPP影响细胞凋亡的机制，本文利用流式细胞技术、报告基因技术、ChIP技术、抑制瘤模型等分别调查了iASPP、iASPPRNAi、p53、p63、p73等对凋亡基因转录能力的影响，探讨iASPP影响凋亡基因的转录机制，阐明p53家族的凋亡通路中影响细胞凋亡的作用因子。本文研究结果有助于了解iASPP的异常调控与肿瘤发生、发展的关系，并有望成为肿瘤治疗的新靶点。方法：1．向不同类型p53肿瘤细胞(U20S，H1299，SW480)内中转入iASPP干扰质粒，用AnnexinV．FITC方法在流式细胞仪上

4、检测细胞凋亡的变化，用DNAladder方法观察凋亡细胞的形态学改变。2．用CCK-8计数法观察外源性转入iASPP和将内源性iASPP干扰后，对不同类型p53肿瘤细胞增殖的影响。3．通过体外转录／翻译偶联系统分别表达iASPP、p53、p63、p73，再用免疫共沉淀7第三军医大学博士学位论文和Westernblot方法观察在体外iASPP与p53／p63／p73之间的相互作用。4．通过细胞转染、免疫沉淀和Westernblot等技术研究iASPP对细胞内p53／p63／p73表达的影响。5．将iASPP质粒、iASPP干扰RNA质粒和Bax．Luc／Puma-Luc报告基因质粒分别转染入U2

5、0S，H1299，SW480细胞，测定荧光素酶的荧光读数，观察iASPP对报告基因转录活性的影响。6．利用细胞转染和Western．blot技术观察iASPP干扰前后细胞内iASPP的表达变化。7．将Bax／Puma报告基因、p53质粒、p63质粒、p73质粒和对照质粒分别转染入U20S，H1299，SW480细胞，测定荧光素酶的荧光读数，观察p53质粒、p63质粒、p73质粒对报告基因转录活性的影响。8．用染色质免疫沉淀技术研究干扰iASPP后X@p63／p73和凋亡基因启动子区的DNA片断结合的影响。9．裸鼠皮下注射肿瘤细胞制备裸鼠移植瘤模型，瘤内分别注射iASPP和RNAi质粒观察肿瘤生

6、长情况。10．用TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡。肿瘤组织制成石蜡切片后行HE染色，光镜下观察肿瘤细胞形态的改变11．以肿瘤组织的RNA为模板进行RT—PCR检测，观察对照组和干扰组中iASPP的表达变化。厶七田-‘1：17卜1．iASPP干扰质粒转入肿瘤细胞(u20s，H1299，SW480)后，三种肿瘤细胞中细胞凋亡明显增加。2．iASPP转入肿瘤细胞后，肿瘤细胞增殖加快。干扰iASPP后，肿瘤细胞增殖受到抑制。3．通过体外转录系统，证实TiASPP能与p53、p63矛'1]p73结合。4．细胞实验表明，在三种不用类型p53的肿瘤细胞中，iASPP均能与p53、p63和p73厶士厶；口口

7、o5．报告基因试验表明，iASPP能降低凋亡基因的转录活力。干扰iASPP后能增强凋亡基因的转录活力。6．iASPP干扰U20S，H1299和SW480前后，三种肿瘤细胞内p53／p63／p73的表达维持不变，说明第三军医大学博士学位论文7．报告基因试验表明，p53／p63／p73能增强凋亡基因的转录活力。8．ChIP实验表明，干扰iASPP后，和凋亡基因启动子区结合的p63／p73增加。9．裸鼠