小鼠阴道上皮细胞与猪脱细胞真皮基质—纤维蛋白凝胶构建组织工程阴道动物模型的初步研究

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1、河北医科大学硕士学位论文小鼠阴道上皮细胞与猪脱细胞真皮基质--纤维蛋白凝胶构建组织工程阴道动物模型的初步研究姓名：张明乐申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：黄向华201203中文摘要小鼠阴道上皮细胞与猪脱细胞真皮基质一纤维蛋白凝胶构建组织工程阴道动物模型的初步研究摘要第一部分：小鼠阴道上皮细胞培养及鉴定目的：探讨小鼠阴道上皮细胞分离、培养和鉴定方法，为构建组织工程阴道提供种子细胞。方法：(1)酶消化法培养：取8周龄雌性昆明小鼠阴道全层，Dispase酶消化后分离上皮层，用胰酶进一步消化成细胞悬液接种到K-SFM培养液中a(2)观察与鉴定：倒置显微镜观察细胞形态、贴壁

2、时间、生长特性；MTT法绘制细胞生长曲线；AEl／AE3免疫组化染色鉴定上皮细胞；扫描电镜观察细胞超微结构。结果：(1)消化后细胞多为体积较小的圆形透亮细胞，胞浆均匀；接种后24----48h细胞开始贴壁，变成宽大扁平细胞；3．-一5d细胞增殖显著，形成克隆群；7～10d细胞连接呈铺路石状，融合约80％。(2)使用AEl／AE3对细胞爬片进行免疫组化染色，胞质呈棕黄色，表明细胞角蛋白存在，显微镜下计数细胞纯度达98％以上。(3)扫描电镜观察上皮细胞呈镶嵌排列，表面可见微绒毛和微褶曲。结论：酶消化法原代培养法细胞贴壁快，生长时间短，细胞增殖良好；传代培养细胞生长良好，能较迅

3、速为组织工程阴道的构建提供种子细胞。第二部分：小鼠阴道上皮细胞与猪脱细胞真皮基质．纤维蛋白凝胶支架复合移植物的生物相容性研究目的：构建小鼠阴道上皮细胞与PADM．纤维蛋白凝胶支架复合移植物，并探讨复合支架材料的生物相容性，验证此种构建方式的可行性。方法：(1)将纤维蛋白原、凝血酶、抑肽酶、CaCl2溶液以不同顺序和浓度混合，观察纤维蛋白凝胶形成时间、降解时间、凝胶固化后的硬度等，选择最佳的混合比例。(2)将小鼠阴道上皮细胞接种到纤维蛋白凝胶内培养，观察细胞生长情况。(3)构建小鼠阴道上皮细胞与PADM．纤维蛋白凝胶支架复合移植物，将其埋植Nd,鼠脊柱两侧皮下。于移植后2、

4、4、8和12周取材，大体观察后制成组织切片，行HE染色和VG染色，观察中文摘要和评价移植片组织的生长状况；用AEl／AE3进行免疫组化染色，以证实是否有上皮组织形成。结果：(1)小鼠阴道上皮细胞在凝胶中呈三维均匀分布。培养6h可见细胞有多个触角向三维空间伸出，12h后大部分细胞有多个触角伸出，生长良好。(2)皮下移植后大体观察：各取材时间未发现感染与免疫排斥反应。(3)皮下移植后组织观察：皮下埋植后2周，可见少量阴道上皮细胞；4周形成上皮，仅2"--'3层；8～12周上皮层数增多。VG染色显示随埋植时间推移PADM内逐渐有细胞长入，结构逐渐降解。AEl／AE3免疫组化染色

5、结果与HE染色结果一致，证实有上皮组织形成，但是上皮细胞无极向排列。结论：PADM．纤维蛋白凝胶支架具有良好的生物相容性，与小鼠阴道上皮细胞构建移植复合物体内移植后有血管长入，形成的上皮组织表型与正常阴道上皮表型相同。第三部分：小鼠阴道上皮细胞和猪脱细胞真皮基质体内与原位构建组织工程阴道的比较研究目的：观察原位组织构建与体内构建两种方式在小鼠体内进行阴道构建的效果，探讨组织工程阴道的构建方式。方法：将昆明小鼠随机分为A、B两组，行阴道全切后进行阴道重建。A组植入PADM行原位阴道组织构建；B组植入小鼠阴道上皮细胞与PADM．纤维蛋白凝胶移植复合物行体内构建。于移植后2、4

6、、8、12周取出重建阴道组织进行大体观察，并分别进行HE染色、VG染色和AEl／AE3免疫组化染色，以动态观察重建阴道组织生长情况及PADM降解情况。重建术后12周B组重建阴道组织用透射电镜观察其超微结构。结果：A组重建阴道在移植后2周可见约2"--3层上皮层形成；移植后4周细胞层数增加，但细胞排列无极向；移植后8、12周上皮层结构接近正常小鼠阴道上皮层结构。B组移植后2周上皮结构即接近正常小鼠阴道上皮层结构；移植后4、8、12周上皮层结构同移植后2周。两组均可见PADM结构随时间推移逐渐疏松，移植后12周A组PADM部分区域结构不完整，B组PADM仍保持基本形态。AEI

7、／AE3免疫组化染色结果与HE染色结果一致。B组透射电镜观察可见上皮细胞之间由桥粒连接，上皮细胞与基底膜之间半桥粒连接。上皮层下见成纤维细胞、无髓神经纤中文摘要维与毛细血管。结论：利用PADM进行原位组织构建与体内构建在实验动物体内均能够完成阴道重建。原位组织构建方法简单，但阴道上皮化形成所需时间较长，较易出现阴道狭窄与闭锁：体内构建过程相对复杂，但是上皮化形成所需时间短。利用组织工程技术为阴道重建术提供组织里衬具有可行性。关键词：阴道成形术；组织工程；细胞培养；脱细胞真皮基质：纤维蛋白凝胶英文摘要TissueEngineer