小鼠脂肪组织特异表达fat-1基因载体的构建

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1、Constmc’tionofMouseAdiposeTissue。specificExIVectortzxpresslonVectorotn亿t—I一了Qt一1GeneThesissubmittedt011eslstoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof‘MasterofAgronomy一HuaXiaomin(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor

2、：Prof．PanQingjieQingdao．ChinaJune，2012独创性．声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：缉嘭钆时间：p．2年击月h关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保

3、留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：笠甘笔钛时间：冽2年。6月≥夕日导师签名：己7W时间：yf1年ob月弓口日，青岛农业人学l{

4、jj-I：学位论文摘要小鼠脂肪组织特异表达fat．1基因载体的构建及表达摘要fat．1基因来源于秀丽隐杆线虫C．elegans，翻译产物是03．3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶，此酶的功能是以18．20碳的∞．6

5、PUFAs为底物进行脱氢反应，生成相应的(o．3PUFAs，平衡体内∞一6／co．3PUFAs的比例，对于预防和治疗心脑血管、肿瘤、精神分裂症等疾病有重要的作用。海洋生物、蔬菜和一些坚果中含有丰富的(o．3PUFAs，而肉类食品中的f．O．3PUFAs却很少，因此，通过饮食方式摄取∞．3PUFAs的效率很低；而哺乳动物体内缺乏合成∞．3PUFAs前体的酶，也缺乏能将(D．6PUFAs转化为∞．3PUFAs的酶，这使得通过在哺乳动物体内增加外源性的(0．3PUFAs脱氢酶来增加(0．3PUFAs的含量成为一个可取的途径。秀丽

6、隐杆线虫属于真核生物，但是其基因编码方式更接近于原核生物，为了实现fat．1基因在小鼠脂肪中的表达，本实验将fat．1基因按照真核生物密码子偏好性进行了密码子的优化，合成、测序后，采用定向克隆的方法将其重组于pcDNA3．1(+)载体上，构建pcDNA3．1．fat．1(+)真核表达载体。过去的研究表明，利用转基因技术可以实现外源基因的非特异性广泛表达，然而，这种外源基因的非特异性广泛表达往往会对转基因动物本身造成负面影响，而这种影响很有可能是由目的基因的异位表达造成的，即外源基因在它原本不表达的组织发生表达，脱离了正常的

7、生理轴制约，从而使表达产物的生理功能发生改变。目前，解决异位表达问题的一个有效途径就是构建外源基因的特异性表达载体，将目的基因的表达限制在单一或少数必要的组织器官中。这样既可实现转基因的目的，又可避免目的基因在不必要的组织器官中表达带来的负效应。具体到fat．1基因，我们希望它的表达能够限制在脂肪组织中，对于哺乳动物而言，脂肪酸的合成几乎都是在脂肪组织内完成的，而同时脂肪组织也是人类消费畜产品的重要形式。要构建一个特异高效表达的表达载体，启动予的选择-ql--常重要。J自动子是一段位丁二结构基因5’端上游区的DNA序列，能

8、活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。增强子是指增加连锁基因转录频率lIl勺DNA序列，其通过启青岛农业火学硕一I．-学位论文摘要动子增加转录。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，其能刺激在它附近的任一启动子，并且增强子具有组织特异性，例如免疫球蛋白基因的增强子只有在B淋巴胞内活性刁‘最高。除此以外，在胰岛素基因和胰凝乳蛋白酶基因的增强子中也发现有很强的组织特异性。ap2基因编码一种脂肪组织特异蛋白。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(Ap2，p2adipocyteprotein)，有研究表明，

9、该基因转录起始位点上游．4．9kb到．5．4kb的518bp的增强子序列是ap2基因组织特异性表达的主要决定元件，．1．7kb至lJ+21bp是该基因有启动活性的最小启动子序列。本实验克隆了ap2基因最小启动子序列1900bp和518bp的增强子序列，通过酶切连接到EGFP(EhancedGreenFl