以cik细胞为载体的携带il-2嵌入型双调控溶瘤腺病毒的构建

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1、徐州医学院硕士学位论文以CIK细胞为载体的携带IL--2嵌入型双调控溶瘤腺病毒的构建姓名：杜峰申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：郑骏年2012-03徐州医学院硕士学位论文以CIK细胞为载体的携带IL．2嵌合型双调控溶瘤腺病毒的构建中文摘要目的溶瘤病毒作为一种特殊的肿瘤治疗药物或基因治疗载体显示出广阔的应用前景。然而，溶瘤病毒的免疫原性成为限制其广泛应用的瓶颈。为了保护溶瘤病毒免受机体免疫排斥，构建一种新型溶瘤病毒，使其可以利用对肿瘤具有识别和杀伤能力的CⅨ细胞作为运载工具。1．缺失病毒病毒复制必需基因E1855如的同时利用h11ERT启动子替换E1A启动子，

2、保证病毒仅在肿瘤细胞中增殖，提高CⅨ细胞运载病毒的安全性；2．利用Ad35纤毛hob和sh心替换Ad5的knob和shafI，提高病毒对CIK细胞的感染能力；3．利用也．2作为病毒携带的治疗基因，提高病毒的抗肿瘤能力。构建双调控嵌合型溶瘤病毒Ad5／F35．hTER工ZD55．IL．2，利用细胞实验初步检测CⅨ细胞对其的运载能力。方法1．构建穿梭质粒pZD55．IL．2：以删A3．1．IL．2质粒(实验室保存)为模板，设计引物，分别引入SalI和B觚lHI酶切位点，PCR扩增得到IL．2的cDNA，SalI和BaⅡlHI双酶切并纯化PCR产物，克隆进质粒pPCAl

3、3(实验室保存)，构建质粒pPCAl3一IL一2并测序；使用B百II酶切质粒pPCAl3．IL．2，电泳回收酶切产物，纯化获得含CMV启动子的CMv．IL．2基因片段，克隆进质粒pZD55(实验室保存)，构建pZD55．IL．2，酶切鉴定并测序。2．构建穿梭质粒phTEImZD55．IL．2：使用KpnI和PⅦI双酶切质粒pzD55一IL一2和phTERT-ZD55(实验室保存)，电泳酶切产物并分别纯化回收pZD55．IL-2的小片段和phTEImZD55的大片段，连接获得质粒phTEI汀．ZD55一IL．2，酶切鉴定并测序。同时构建对照质粒phTEImZD55．

4、EGFP，方法同上。3．新型溶瘤腺病毒的重组、包装和鉴定：利用穿梭质粒phl、EIH-ZD55、phTERT-ZD55一IL·2、phTERT．ZD55一EGFP，分别与嵌合型骨架质粒pBHG．丘ber5／35通过LipofectaIninc2000共转染293细胞，9．14天后出1徐州医学院硕士学位论文现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取病毒DNA并应用PCR鉴定，鉴定正确的腺病毒分别命名为Ad5／F35-hTER-T-ZD55，Ad5／F35．hTERr-ZD55．IL．2和Ad5／F35．hTERT-ZD55．EGFP。4．体外检测ClK细胞对新型溶瘤病毒

5、的运载能力：不同体外培养MOI：l、10、20、50和100的病毒Ad5／F35．hTERIT-ZD55一EGFP感染CⅨ细胞，分别在感染后的6h、12h、24h和48h，观察嵌合型双调控腺病毒对CⅨ细胞的感染能力及感染后CⅨ细胞的存活时间。结果1．酶切鉴定和测序表明质粒pPCAl3．IL一2、pZD55-IL．2构建成功。2．酶切鉴定和测序表明质粒phl日mZD55．IL．2、phTER．T-ZD55-EGFP构建成功。3．PCR鉴定表明病毒Ad5／F35．mRT-ZD55，Ad5／F35一hTEl{T-ZD55-IL一2，Ad5J／F35-hTER-T-ZD5

6、5．EGFP，包含目的基因，且无野生型腺病毒污染。4．MOI-10时病毒对CⅨ细胞的感染能力已达到30％(14／46)，且CⅨ细胞存活不受病毒的影响。结论成功构建的嵌合型双调控溶瘤腺病毒Ad5／F35一h1聊mZD55．IL．2，能够被CⅨ细胞高效运载，且不影响CⅨ细胞的活性，为进一步研究CⅨ细胞联合溶瘤腺病毒抗肿瘤的动物实验及联合作用机制的探讨奠定了基础。关键词溶瘤腺病毒；IL一2；hTERT启动；CIK细胞；肿瘤治疗4徐州医学院硕士学位论文Constructionandidenti丘cationofAd5／F35chimericoncOIyticadenoVi

7、ruswithhomanIL一2geneandcarriedbyCIKcellsAbstI．actobjec伽eAsaspecialkiIldof0ncol如cdrugorgene恤黝pyVeCt0璐，oncol如c、，irusstl0、ⅣsblDadprosl圮ct．HoweVer'itsinlmunogenici够k地amettleceilingofcliI】icalapplication．IIlordertoproteCt也ev洳-lSf．romhost’siIl如嘲nolo西cal蝎e‘垴on，wecolls缸uctanewkilldofoncolytic

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