缺氧对小鼠骨骼肌离体线粒体膜通透性转换孔功能的影响

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1、温州医学院硕士学位论文缺氧对小鼠骨骼肌离体线粒体膜通透性转换孔功能的影响姓名：彭艳艳申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：王小同2012-05-23温州医学院硕士学位论文缺氧对小鼠骨骼肌离体线粒体膜通透性转换孑L功能的影响中文摘要目的本研究采用离体线粒体缺氧模型，探讨缺氧对小鼠骨骼肌离体线粒体结构的影响，并通过测定离体线粒体MPTP、膜电位和CytC及SOD、GSH、MDA来反映缺氧对离体线粒体功能的影响和引起的氧化应激反应。方法(1)实验分组：选用7-9周龄SPF级C57BL／6雄性小鼠36只，随机分成两组，第一组为常氧对照组(n=18)，第二组为缺氧组(n=18)。(2)小鼠骨骼

2、肌线粒体的提取：小鼠直接用颈椎脱臼法处死，分离取两后肢股四头肌，立即放入40C预冷的PBS冲洗两次，仔细去除PBS，将组织剪碎后加800此PBS液，玻璃匀浆器冰上研磨后1000xg，40C离心3min，弃上清液，沉淀物加入8009LBSA／A液，漩涡振荡5s(中速)，冰上孵育最长2min，再加入10MLB液，漩涡振荡5S(高速)，冰上孵育5min，并且每一分钟高速振荡一次，后再加入800gLC液，倒置混匀，不可振荡。700×g，4。C离心10min后弃沉淀将上清转移到2mL管中，12000xg，4。C离心15min，弃上清液，保留沉淀，在沉淀中加入500laLWashBuffer，120

3、00×g，4。C离心5min后弃上清液，得到线粒体沉淀，在沉淀中加入2009L线粒体冻存液制成线粒体悬液。整个提取过程均在冰浴中(0—4。C)进行，提取的线粒体冰上保存，当天检测指标。(3)离体线粒体缺氧模型的制作：提取线粒体后，缺氧组将0．5mL的线粒体悬液加入2mL的密闭容器中，保持37。C并向内通入100％氮气及氧清除剂Na2S2040．5mmol‘L。致P02测不出来，保持30min。常氧组：线粒体悬液置于空气中，其他条件同缺氧组。(4)观察指标：①超微结构观察：采用H．600型透射电镜观察线粒体形态和结构的变化。②分子生物学指标：采用荧光分光光度计检测骨骼肌离体线粒体膜电位，酶

4、标仪检测线粒体膜通透性转换孔开放程度，ELISA法检测CytC含量，分光光度计法检测SOD活性和GSH、MDA含量。结果(1)小鼠骨骼肌离体线粒体电镜观察结果：透射电镜下可见常氧组骨骼肌线粒体为椭圆形，嵴清晰，排列较整齐，双层膜结构较完整；缺氧组线粒体肿胀明显，嵴不规则断裂甚至消失，线粒体空泡化，线粒体外膜破损明显。(2)骨骼肌线粒体膜通道孑L开放状态测定：以待测样本的吸光值比值来代表线粒体膜通道孔的开放状态，吸光值越低，表示膜通道孔开放增加。与常氧组比较，缺氧组骨骼肌线粒温州I医学院硕士学位论文体的吸光值比值明显降低，代表缺氧组膜通道孔开放增强，差异有统计学差异。(3)线粒体膜电位测定

5、：与常氧组相比，荧光分光光度计的定量测量结果提示缺氧组线粒体膜电位明显降低，差异有统计学差异。(4)线粒体释放的CytC含量测定：与常氧组相比，缺氧组线粒体释放的CytC含量明显增加，差异有统计学差异。(5)线粒体SOD活性和GSH、MDA含量测定：缺氧组和常氧组相比，缺氧组的线粒体SOD活性明显降低，GSH含量明显降低，MDA含量明显升高，差异有统计学差异。(6)结果提示：①缺氧可引起小鼠骨骼肌离体线粒体超微结构损害，使得线粒体肿胀，嵴断裂甚至消失，线粒体空泡化。②缺氧可导致离体线粒体膜通透性转换孔开放增加，使线粒体膜电位降低，释放CytC。③缺氧组线粒体SOD活性明显降低，GSH、M

6、DA含量明显升古同。结论(1)缺氧可导致骨骼肌离体线粒体肿胀，嵴断裂甚至消失，线粒体空泡化，引起线粒体结构损害。(2)缺氧可引起离体线粒体MPTP放增加和氧化应激损伤，线粒体的功能障碍与MPTP的开放增加和氧化应激有关。关键词：线粒体；骨骼肌；离体；缺氧；膜通透性转换孔；细胞色素c；氧化应激；小鼠Disfunctioninmice’MPTPofisolatedskeletalmuscleinducedbyhypoxiaAbstractPurposeInthisstudy，theisolatedmitochondriamodelofhypoxiawasusedtoinvestigateth

7、eimpactofhypoxiaonthestructureandtheeffectiononthefunctionofmice’mitochondriaofisolatedskeletalmusclebymeasuringtheresponsetohypoxiaonMPTP,membranepotential，CytCaswellasthebiochemicalindicatorsofoxidativestress，includi