酶的定向进化技术研究进展

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1、酶的定向进化技术研究进展摘要随着科学技术的发展人们对酶的各级结构、酶的功能以及酶的催化机制等有了进一步的认识，新的酶或酶的新功能不断被研究发现。但是由于酶本身在复杂的工业生产环境屮的稳定性、酶活性等特性并不如人意，因此其广泛应用仍受到限制。而酶的定向进化技术对酶的改造则使得酶额应用更加广泛。许多种新酶种类或酶的新特性被开发出来，这必将对工业、对农业、对食品业、对环境保护、对药物开发甚至对人们的生活都产生重要的影响。关键词：酶，定向进化引言随着自然科学的迅速发展，酶学研究也开展的如火如荼，从1926年，美国科学家萨姆钠(J.B.Sumner,1887—1955)从刀豆种子中提取

2、出腺酶的结晶，并通过化学实验证实脓酶是一种蛋白质，到20世纪80年代，美国科学家切赫(T.R.Cech,1947—)和奥特曼(S.Altman,1939—)发现少数RNA也具有生物催化作用以来，人们对酶的各级结构、酶的功能以及酶的催化机制等有了进一步的认识，新的酶或酶的新功能不断被研究发现。如今，酶已经应用于酿酒工业，酱油、食醋的生产，食品添加剂的生产，甚至洗衣粉中也有酶的应用，如加酶洗衣粉，可以使洗衣粉效率提高，使原来不易除去的汗渍等很容易除去等等，酶的应用已具有非常广阔的前景⑴。由于酶的应用广泛，酶的提取和合成就成了重要的研究课题。然而，就目前从自然界中发现和鉴定的几千种

3、酶来说，真正能够进行大规模生产和应用的商品酶却不多。大量的天然酶尚无法被提取或合成出来，从而在复杂的工业生产环境中得到应用。此外，应用于工业生产环境的酶的催化反应条件通常为高温、高压、极端pH、高盐及存在有机溶剂、含有去污剂或氧化剂等极端环境，而天然酶在这些极端工业生产环境中的性质发生了很大变化，甚至变性失活，难以满足工业催化的要求。因此需要获得具有新功能和特性的酶。定向进化技术出现以前获得具有新功能和特性的酶的途径通常为：一是在自然界中寻找，但是由于不具有针对性，很难有满意的结果；二是利用定点突变技术改造现有的酶，但是定点突变技术只能对现有的酶的少数氨基酸进行替换、删除或插

4、入，无法改变酶蛋白的高级结构，对酶的改造有限。定向进化技术可以人为地改变天然生物催化剂的某些性质，从而为酶的公寓应用提供了有效的工具，为新酶的发现提供了新的途径，创造了新的机会。该技术可在实验室中模拟自然选择过程来达到酶进化的目的，将酶在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短到几年、几个月甚至更短，加速了酶的进化过程，增强在不良环境中的稳定性，甚至创造出新酶种类〔2句。1酶的定向进化的定义酶的定向进化是指在不需要事先了解酶的空间结构和酶的催化机制的条件下，通过各种突变方法向编码酶蛋白的基因中引入突变，突变的基因可以通过重组如DNA改组等方法进行重新组装，提高基因进化的效率。

5、这些被改造的基因可以编码具有新特性的酶蛋白，得到酶蛋白突变文库，再利用筛选或选择的方法在酶蛋白突变文库中获得具有目的性能的突变株。2酶的定向进化的原理定向进化是利用TaqDNA多聚酶不具有9-5,校对功能的性质，并结合基因工程现有技术手段，在待进化酶基因的PCR扩增反应中，配合适当条件，以很低的比率向目的基因屮随机引入突变，并构建突变库。凭借定向的选择方法，选出所需性质优化的酶，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是：“获取所筛选的突变体”。简言Z,定向进化就是随机突变同选择或筛选相结合。与自然进化不同，定向进化是受人为控制的，起着选择某一方向的进化而除掉其他方向突变的作用

6、，整个进化过程完全是在人为条件控制下进行的⑹。3酶的定向进化的方法定向进化包括两个基本步骤：(1)构建目的酶蛋白的突变体库；(2)对不同突变基因表达的酶蛋白进行筛选，找到目标突变体。3.1构建目的酶蛋白的突变体库目前，构建目的酶蛋白的突变体库的主要方法有易错PCR、DNAShuffling>随机引物体外重组法、交错延仲重组法、3.1.1易错PCR易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入镒离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋

7、白质分子的随机突变体。其关键在于对合适突变频率的选择，突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变;突变频率太低则会导致文库中全是野生型群体。理想的碱基置换率和易错的最佳条件主要依赖于突变的DNA片段的长度。为改变细胞色素CYP102A2的催化活性，Axarli和Labrou采用易错PCR对其进行定向进化实验,，构建突变体库，通过活力测定筛选突变体。实验得到的CYP102A2突变体(Prol5Ser)的酶活性明显加强，并且其底物是一系列的芳香族和脂肪族⑺。3.1.1DNAShufflin