人类精子超低温冷冻氧化损伤机制与ucp2表达的初步研究

《人类精子超低温冷冻氧化损伤机制与ucp2表达的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、温州医学院硕士学位论文人类精子超低温冷冻氧化损伤机制与UCP2表达的初步研究姓名：张秀菊申请学位级别：硕士专业：中药学指导教师：董巧香2012-05-19温州医学院硕士学位论文人类精子超低温冷冻氧化损伤机制与UCP2表达的初步研究摘要线粒体氧化磷酸化是精子能量的主要来源之一，也是产生ROS的主要来源。人类精子在形成过程中失去大部分的细胞器、含有抗氧化物质的胞浆和线粒体基质，因此精子的抗氧化体系是有缺陷的。当线粒体ROS升高时，精子就可能发生一系列氧化应激反应。温和的解偶联作用是正常细胞调节ROS平衡的主要方式之一。激活解

2、偶联蛋白2(UCP2)和添加外源性解偶联剂DNP均有可能提高精子活力。本研究主要内容为：1)精子动力与氧化损伤之间的关系；2)超低温冷冻对精子氧化损伤和能量代谢的影响；3)不同活力精子中UCP2的表达情况；4)添加外源性解偶联剂DNP对冻精的影响。精子动力参数用CASA检测；线粒体膜电位用JC—l结合流式细胞术检测；H202用DCFH．DA和PI双染色法结合流式细胞术检测；MDA用TBA比色法检测；02‘用DHE和YO．PRO．1双染色法结合流式细胞术检测；ATP用多功能酶标仪检测；精液的超低温冷冻采用液氮蒸汽法；UCP

3、2mRNA用q．PCR,法检测；UCP2蛋白表达水平用WestemBlot法检测。在精子动力与氧化损伤之间的关系研究中，主要研究精子动力参数(快速前向运动、活力和活率)与线粒体膜电位、ROS(H202)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)之间的相关性，以及弱精线粒体膜电位、ROS(H202)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)与正常精子之间的差异性。线粒体膜电位与精子快速前向运动(a)(r=0．47)、活力(a+b)(r=O．58)和活率(a+b+c)(r=0．58)均有极显著意义的正相关关系口<0．01)。正常组线粒体膜电位显

4、著高于弱精组(P<0．05)。H202含量与精子活率(PI．％)有显著意义的正相关关系(r=0．42，P<0．05)，『F常组与弱精组没有显著性差异(P>0．05)。荧光共聚焦观察到整个精子都有少量H202，但中段即线粒体螺线集中部位产生大量H202。精子脂质过氧化产物MDA与精子前向运动(r=一O．57)、活力(r=．O．54)和精子活率(r=．0．46)均有极显著意义的负相关关系(P<0．01)，正常组MDA显著低于弱精组(P<0．05)。结果表明精子动力与线粒体完整性和氧化损伤程度有相关性，中段线粒体螺线是精子RO

5、S的主要产生部位，弱精氧化损伤显著高于正常精子。在超低温冷冻对精子氧化损伤和能量代谢影响的研究中，主要研究了超低温冷冻前后线粒体膜电位、ATP、ROS(H202)和MDA的差异性。超低温冷冻后，2温州医学院硕士学位论文冻精膜电位和ATP含量显著降低(P<0．01)，H202、凋亡率和MDA均显著增加(P<0．05)，凋亡率显著升高(P<0．01)。结合第一部分研究结果，表明精子线粒体氧化损伤和能量代谢受影响是导致超低温冷冻后精子活力低下的原因。在人类精子UCP2的表达研究中，主要研究了不同活力精子的UCP2基因和蛋白表达

6、水平。UCP2mRNA表达水平与精子前向运动(r=0．43)、活力(r=0．44)以及活率(r=0．36)均有极显著意义的正相关关系(P<0．01)，正常组UCP2基因表达水平显著高于弱精组(P<0．01)。个别正常活力精液样本可检测出UCP2蛋白表达，大多数样本不表达或表达量很低。结合前两部分研究结果，弱精和冻精都容易受氧化损伤，可能是因为精子缺乏线粒体基质抗氧化物质，也有可能是由于其UCP2蛋白表达水平低的缘故。在添加外源性解偶联剂对冻精影响的研究中，主要研究了不同浓度(0，0．1，1，10和100肛M)的DNP抗冻

7、液对冻精活力、ROS(H202并1302‘)和ATP的影响。O．1和1“M组的DNP均能显著提高冻精活力(P<0．1)，10和100}tM组与对照均没有显著性差异。0．1，1，10和100}tM组对冻精ROS(H202和02‘-)和ATP均没有影响。上述结果表明，DNP是一种很好的精子抗冻添加剂，能在不影响能量代谢和诱导产生ROS(H202和02‘-)的情况下提高精子活力。关键词：超低温冷冻、精子、线粒体、ROS、UCP2、DNP温州医学院硕士学位论文TheMechanismofOxidativeDamageduring

8、CryopreservationandtheUCP2ExpressioninHumanSpermaozoaAbstractMitochondrialoxidativephosphorylationisoneofthemainsourcesofenergyforsperm，butalsoisthemainSOurCeo