海水鱼类精子超低温冷冻保存及损伤的研究

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1、万方数据Cryopreservationanddamageresearch0tmarInenSnSpermn●mlThesi：；ubmittedtohesIsSUdaoAgriculturalUniversity111FulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomy一ZhangXuelei(DepartmentofMarineScienceandengineering)Sul："WangWenq"Supervisor：wenqlLiuQinghuaQingdklo．ChinaJune，2013万方数据独创性声明本人声明所呈交的论

2、文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：兰≥渗撇／帆∥7乡年7月／日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段傈存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内

3、容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生虢疆刍磅帆和，夕年7月／日铷签名1沃遘mJ'l'日-j：1lj年>月7El万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要海水鱼类精子超低温冷冻保存及损伤的研究摘要‘现阶段对鱼类精子超低温冷冻保存的研究较少。超低温冷冻保存会引起精子的机械损伤，从而进一步导致活性氧(ROS)的产生。而过量的活性氧会引起精子质膜的过氧化反应，从而导致冷冻精子运动率、运动速率、寿命和受精率等的降低。本论文是以保存在精子库中的大菱鲆(ScophthaImusmax／mus)、大泷六线鱼(Hexagranrnosotaki力、夏鲆(Para，ichthysdentatus)和真鲷(砌

4、∥船majo厂)的冷冻精子作为研究对象，通过计算机辅助分析系统和电子显微镜对这几种冷冻精子的运动率、运动速率、寿命、超微结构的观察，通过分光光度法对精子中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)等酶含量的测定和丙二醛(MDA)含量的测定，以及通过流式细胞术对精子ROS含量、质膜和线粒体功能的检测，系统的研究了超低温冷冻保存以及外源抗氧化剂对鱼类精子生理功能、抗氧化系统的影响。研究结果如下：1．大菱鲆和大泷六线鱼的新鲜精子的平均路径运动速率，运动率和寿命都要显著高于冷冻精子(P<0．05)。新鲜精子的生理特性好于冷冻精子。大菱鲆鲜精的ROS含量显著低于冷冻精子(P<0

5、．05)。2．同时通过电镜法进行超微结构分析发现：正常大菱鲆精子和六线鱼精子包括头部，中部和尾部3部分。大菱鲆精子的鞭毛长53．186±2．67um，六线鱼精子的鞭毛长度12．83±0．76Llm。精子的质膜和核膜紧贴。大菱鲆鲜精的线粒体13个左右，分布于不同的水平上，而六线鱼鲜精的线柱体只有两个，分布于同一水平上。大菱鲆和六线鱼精子经过超低温保存后，40％-60％的精子基本保持正常的的形态结构，其余精子遭受不同程度的损伤，主要有：精子头部损伤和精子线粒体损伤，以及精子质膜、核膜的损伤，还有精子形状的改变，其中膜损伤为主要损伤，损伤精子中60％-70％带有膜损伤。我们推测大菱鲆精子在冷冻解冻过

6、程中遭受到的机械损伤可能是导致冻精生理活性显著下降的主要原因。3．不同保存时间鲆冻精的运动率、受精率和孵化率与保存时间的长短没有明显的关系。夏鲆冻精的运动率与受精率呈相关性。在繁殖周期内夏鲆精子的质量随着时间的推移先升高，后降低。4．不同保存时间真鲷冻精的解冻后的运动率随着冷冻年份的增加而降低，但是差异不显著(P>O．05)。保存7年和5年的真鲷冻精的寿命为5天，低于其他年份的6天。ROS含量随着保存时间的增加而增加(P<0．05)。5．与新鲜精子(87．58±2．88％，)相比真鲷冷冻精子(66．80±5．55％)的运动率显1万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要著下降(P

7、说，绝大多数加入外源抗氧化剂的冷冻精子的生理数据要好于普通冻精。加入100mH海藻糖、25训牛磺酸、50棚牛磺酸、100mM牛磺酸这四种外源抗氧化剂的冷冻精子的运动率和寿命要显著高于普通冻精。加入1OOmM海藻糖、25栅牛磺酸、50ram牛磺酸、100mM牛磺酸这几种外源抗氧化剂的冷冻精子的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽等酶的含量和丙二醛含量与普通冻精没有显著差异(P>0．05)。根据流式细