西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存研究及冷冻损伤观察

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1、上海水产大学硕士学位论文西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存研究及冷冻损伤观察姓名：刘鹏申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：庄平;章龙珍20070510上海水产大学硕士学位论文人工养殖西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存研究及冷冻损伤观察摘要西伯利亚鲟主要分布于鄂比河到科罗马河的所有大河中。我国养殖的西伯利亚鲟主要为以受精卵方式从俄罗斯引进，目前其养殖地位已经跃居我国各养殖鲟鱼种类之首，随着养殖技术的不断提高，现已在我国实现了全人工繁殖。然而，在我国野生种质资源匮乏的情况下长期人工繁殖，很可能产生种质退化，遗传多样性降低，抗病抗逆性能降低等现象。精

2、子超低温冷冻保存使种质的长距离运输得以实现，以上问题便可迎刃而解。另外精子超低温冷冻保存也可用于杂交选育、提纯复壮、雄核发育等方面，对建立种质资源库，保护鲟鱼这种濒危物种也起到积极的指导作用。本文通过对鲟鱼精子生物学的研究，制定一套适合西伯利亚鲟精子冷冻保存简易方法。利用扫描和透射电镜对西伯利亚鲟精子冷冻前后形态和超微结构做了详细的研究，进一步探讨精子冷冻损伤的机理、评估精子保存的效果。1．西伯利亚鲟精子生物学特性及冷冻保存方法人工养殖7龄西伯利亚鲟产精量为113．67±39．86ml，精子密度为(6．49±3．10)xlOS／ml，特子活

3、力为(85．44-9．5)％，精子寿命为353±23s，糖浆渗透压为113±5．7mOsm／L。第二次和第三次产精质量优于第一次产精。精子密度与精子快速运动时间、精子寿命之间均存在线性相关，用方程分别表示为：y=1．0384x+1．5089(R2=0．7325)；Y=2．9069x+74．289(舻=0．6967)。精子密度可作为一项精子质量评价的标准。不同离子对西伯利亚鲟精子活力影响很大，其中K+对精子起抑制作用，而Na+，Ca2+，M92+对精子起激活作用。通过比较西伯利亚鲟精子在不同稀释液、不同抗冻剂和抗冻剂浓度、降温速率、解冻温度下

4、的保存效果，结果表明：以配方2作为保存精子的稀释液，用18％甲醇作为抗冻保护剂，采用二步法超低温(．196℃)冷冻保存精子，40"C水浴解冻精子，取得最好的冻精活力，冻后精子的活力为(51．84-5．8)％。西伯利亚鲟授精的最佳精卵比为106：1，冻精按此精卵比进行冻精授精，分别得到-f(72．3±3)％的受精率和(52．9±4．1)％的孵化率，其中受精率与鲜精没有显著性差异，孵化率与鲜精有显著差异(户<0．05)。此冷冻方法可用于西伯利亚鲟的种质保存及遗传育种等方面。上海水产大学硕士学位论文2．西伯利亚鲟糖子超微结构西伯利亚鲟精子由一个明

5、显的顶体，细胞核，中段和一根鞭毛组成，总长54．814-1．8陬In。顶体呈帽状覆盖于精子顶端，顶体长0．64±0．09#m，宽0．86±0．10um。项体后端为8条螺旋状排列的后外侧延伸物，长0．32±O．04pm，与精核长轴夹角约30度。顶体此结构有助于种间精卵识别以及精卵识别后锚定卵子。顶体内有颗粒物质。精核为前端细(o．784-0．13um)后端粗(1．11±O．12#m)的棒状，长5．24±O．39pm。核内有3条内切沟，始自植入窝螺旋状延伸至项体。紧接精核的为中段，长1．83±0．2缸In，宽0．72±0．1mm，内有中心粒复合

6、体、线粒体等结构。近端中心粒为9组三联微管组成的风车状结构，近端中心粒与远端中心粒呈“+”形排列，两者长轴与核长轴两两垂直。此种排列方式未在其他鲟鱼中报道过。线粒体在中段外围分1．2层排列，细胞质鞘中也可观察到条状线粒体。中段线粒体周围及鞭毛轴丝附近有不明颗粒状物质分布。鞭毛自中心粒复合体下延伸而出，长47．73±2．109m，轴丝为典型“9+2”结构。鞭毛穿过细胞质鞘后，在与轴丝中心微管平行方向两侧先后长出两条侧鳍，侧鳍宽O．63±0．1私m，偶见3条侧鳍的鞭毛。此种精子侧鳍着生方式未见在其他具有鞭毛侧鳍的鱼类中报道。鲟鱼精子形态特点、结

7、构特点(如：精予中心粒复合体着生方式)将为鲟鱼类分类及进化研究提供客观依据和佐证。3．西伯利亚鲟精予冷冻损伤经过冷冻保存的精子形态发生了很大变化。精子顶体长、精子头中部宽、头中部宽与前部宽比值及中段宽与鲜精相比显著增加(P

8、心粒等微管系统基本完好。部分受损精子出现顶体丢失，中段脱落，鞭毛自中段基部断裂的现象。冻后精子活力下降主要是由于精子结构、生化损伤造成的。关键词：西伯利亚鲟，精子保存，精子结构，