乳腺特异表达人bpi蛋白山羊克隆胚胎生产

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1、安徽农业大学硕士学位论文乳腺特异表达人BPI蛋白山羊克隆胚胎生产姓名：桂涛申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：张运海；章孝荣201206摘要人杀芮／通透性增强蛋白(Bactericidalpemleabili够increasingprotein，BPD主要存在于人多形核中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒内的阳离子蛋白，既能够对革兰氏阴性菌发挥杀菌作用又可以中和内毒素作用的抗菌肽类物质，可用于治疗由革兰氏阴性细菌引起的人体感染、脓毒症和脓毒性休克等疾病。此外，BPI还具有增强调理作用、抗真菌、抗原虫和抑制血管生成等生物学功能。在临床医学

2、中有巨大的应用价值，素有“超级抗生素”之美誉。天然抗菌肽来源有限，提取或制备成本高。随着分子生物学和细胞工程技术的发展，哺乳动物的乳腺己成为表达重组药物蛋白的“生物药厂”，即乳腺生物反应器。乳腺生物反应器成功的关键是外源基因能在乳腺组织中高效特异性表达。因此，在乳腺组织特异性表达载体构建成功后，需要对表达元件的有效性和合理性进行验证，从而减少研制乳腺生物反应器的盲目性，节约人力物力，提高效率，因而意义重大。本研究的日的是构建乳腺特异表达hBPI表达载体，用来制作山羊乳腺生物反应器，从而在转基因羊奶中大量生产llBPI蛋白以满足临床需要。具

3、体研究内容如下：(1)取妊娠第60天的黄淮白山羊乳腺组织，采用组织块法进行原代培养，所用培养皿未铺鼠尾胶原等细胞外基质，培养体系为DMEM／F．12+10％(V／V)FBs+1％(V／V)ITs+10n∥mLEGF。通过胰酶差速消化法、高密度连续传代培养法等相结合纯化山羊乳腺上皮细胞系。通过原代培养观察、免疫荧光染色、生长曲线、核型分析、油红染色结等方法鉴定，所分离得到的细胞系为具有一定泌乳功能的乳腺上皮细胞系。(2)设计如下序列：xhoI酶切位点+KozaI(序列+牛B．酪蛋白信号肽+hBPI的CDS序列+XhoI酶切位点。人工合成并克

4、隆至pUC57载体的EcoRV酶切位点处，命为pUC57-hBPI。然后再将其亚克隆至pBC1．Loxp-Neo．Loxp巾BD载体，通过菌液PcR法快速鉴定，并将PCR阳性菌落进行酶切、测序等鉴定。成功构建了乳腺特异表达载体pBCl．Loxp-Neo．Loxp．11BPI。(3)采用脂质体介导法将载体导入C127细胞，经G．418筛选后获得大量单克隆，用胰酶消化收集所有克隆点细胞，添加催乳激素诱导培养。ImPCR检测表明人岔¨可以在mRNA水平表达：weStemblot检测表明BPI可以在蛋白水平表达：淋巴细胞转化实验表明重组的矗Ⅳ具有

5、刺激淋巴细胞增殖和中和内毒素(LPS)的生物学活性。结果表明该载体可以用制备乳腺生物反应器表达hBPI蛋白。(4)通过DNA显微注射法制各转基因小鼠，检测转基因小鼠乳汁中外源蛋白的表达和蛋白活性来评估载体的有效性和合理性。实验最终获得了7只Founder鼠(5早、28)。(5)采用脂质体介导法将pBCl．Loxp-Neo．Loxp-hBPI载体导入雌、雄关中奶山羊成纤维细胞，经G-418筛选14～16天获得大量克隆点，挑取形态好、活力高的单克隆细胞并扩大培养，PCR鉴定外源基因整合到细胞基因组，最终建立了4株转基因细胞系：GZ．GFC．1

6、(早)、GZ．GFC。2(早)、Gz．GFc．3(d)、GZ．GFC．4(艿)。(6)以G亿．GFc．1(早)、GZ．GFC．2(早)、GZ．GFC．3((尹)、Gz。GFc．4(毋)转基因细胞作为核供体，通过SCNT法和HMC生产克隆胚胎。结果表明：4个转基因细胞株均可以支持胚胎发育到囊胚。(7)采用删C法获得了125枚克隆胚胎，移植到15头受体黄淮白山羊。结果显示大部分返情，未返情山羊B超也未检测到妊娠发生。总之，本研究首次构建了乳腺特异表达人BPI蛋白载体，并利用c127绌胞模型验证了载体的生物学功能，首次获得了转人BPI基因山羊克

7、隆胚胎，同时建立了山羊乳腺上皮细胞分离、培养平台。最终为获得乳腺特异表达人BPI蛋白克隆山羊奠定基础。关键词：杀菌／通透性增强蛋白，c127，胚胎，乳腺生物反应器IIHumanbactericidalpermeabili够increasingprotcin(hBPI)isakindotca_nonlcprotein，whichagainstgram．negativebacteriaandneu仃alizescndotoxlnsmhumanpolymorphonuclearnemphils．BPlcanbeusedt0骶atw曲矿锄-neg

8、a：tlvebacterlacausehumaninfections，s印sisandsepticshock锄domerdiseases．Inaddition，BPlwaLsalsofound