具有杀松材线虫活性细菌的筛选和鉴定

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1、引言松材线虫病[Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]，又称松树萎蔫病，是松树的一种毁灭性病害，主要由松墨天牛传播【l】，已在日本、中国、韩国和葡萄牙等国家造成了巨大损失，因此该病已成为世界上许多国家最重要的植物病虫害检疫对象[21。由于该病缺乏特别有效的防治措施‘31，目前主要是采取化学防治。但化学农药存在持效性较差、成本高、易产生抗药性、对环境污染严重等问题，化学药剂的应用正在逐步受到限制。因此，松材线虫病的生物防治已成为该病研究的一个重要发展方向，针对松材线虫的生物防治，主要是杀线活性的生防植物和生防微生物的研究。槠

2、。Oh等【21】通过建立的高通量筛选技术，筛选T206种化合物的杀线活性，发现一种水溶性的化合物(1-n-undecyl-2一【2-fluorphenyl]methyl-3，4-dihydro-6，7-dimethoxy-isoquinoliniumchloride)具有良好的杀线活性。此外，一些植物提取物也被证明具有杀线活性。捕食线虫真菌是自然界中广为分布的线虫天敌，这类真菌能产生各种捕食器官捕食线虫。Saiki等【4J从松树汁液中分离到一种捕食能力很强的捕食性真菌一节丛孢属真菌(Arthrobotryssp．)，林间试验证明用该菌喷洒黑松和赤松幼林，对防治松材线虫病具有一定的

3、效果。W觚g等【51研究--(Drechslerelladactyloides的两个菌株，发现均具有很高的捕食能力，其中一个菌株接种后24h对松材线虫的捕捉率可达100％。Wang等t22】从森林土壤中感病的线虫体内分离出了Evermicola的多个新菌株，生测表明其中一个菌株在4～5d内就能感染致死几乎全部的供试松材线虫，温室试验*D2年的林问试验发现接种的真菌能在松树内生长并感染松材线虫，证明该菌能有助于松树抵抗松材线虫的侵染，有希望成为防控毁灭性的松材线虫病的生防菌。目前已报道的对线虫有生防作用的微生物主要有捕食线虫真菌‘4-引，内寄生真菌‘61、产毒真菌[3,7-8]、杀

4、线放线菌‘9圳1和杀线细菌[1H5】，它们多数来源于陆生环境，少数分离白淡水生境。近年来，对具有杀松材线虫活性的海洋微生物研究有了一定的进展。雷敬超等【loJ从海洋环境样品中分离和筛选出一株链霉菌(Streptomycessp．)，其发酵滤液稀释10倍后仍可使松材线虫校正死亡率达到68．9％。郑海营等【16j从青岛近海海域采集的样品中分离和筛选出对松材线虫具有较强杀线活性的青岛大学硕士学位论文2株巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。Meng-等‘17峙艮道了一株具有较强杀松材线虫活性的海洋真菌(Acremoniumsp．)。本研究拟利用日常生活环境中的微生物资源

5、，通过对腌制芥菜的体表和变质竹笋中的细菌分离和菌株杀线活性测定，以筛选出对松材线虫具较强杀线活性的细菌，为松材线虫病的生物防治提供生物材料和理论基础。．第1章一株具有杀松材线虫活性细菌的筛选和鉴定材料与方法1．1主要材料及试剂松材虫[Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]：由南京林业大学森林资源与环境学院昆虫实验室提供。实验菌种：从腌制芥菜的表面分离所得。营养琼脂(NutrientAgar)和营养肉汤(NutrientBroth)为北京陆桥技术有限责任公司的生产，马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，乙酸乙酯。1．2主要仪器设备表1

6、主要实验仪器设备一览表青岛大学硕+学位论文1．3实验方法1．3．1松材线虫的培养按照配方配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，121℃灭菌20min后倒平板，接种灰葡萄孢(Botrytiscinema)。无菌松材线虫参照郑海营文献【16]中的方法获得，松材线虫的培养参照文献【17】的方法进行，在无菌操作台内将灰葡萄孢(Botrytisc砌P赠∞接种于平皿中的PDA培养基上，置25℃恒温培养箱中培养，当灰葡萄孢菌丝长满培养基时接入无菌松材线虫，25℃继续培养。定期观察，菌丝逐渐消失，培养基表面长满松材线虫，即可收集松材线虫用于生测分析。1．3．2菌种采集用无菌水冲洗芥菜体表，冲洗液采用稀释涂

7、布法涂在营养琼脂培养基上进行分离，在28。C恒温培养箱中培养。然后根据菌落形态的差异选择代表性菌株，将所得的菌株纯化三次后接入斜面培养基中，4℃保存备用。1．3．3细菌滤液的杀线活性及其热稳定性测定(11取细菌的培养滤液0．3mL放入1．5mL的无菌离心管中，另外向离心管中接入O．3mL约600条线虫，混匀后，每隔2h观察松材线虫的死活情况，以不接菌的液体培养基滤液为对照。处理后线虫死活的观察方法为：用微量移液器取30p．L含线虫的混合液于载玻片上，置于体视显微镜下观察，线虫死亡