杀松材线虫海洋真菌h-21的分离鉴定、培养条件与其活性物质分析

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1、引言引言松萎蔫病（Pinewiltdisease，PWD）是一种松属植物的毁灭性流行病害[1]，它是由松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）及其携带的致病菌共同作用引起的。在我国该病的传播媒介主要以松墨天牛（MonochamusalternatusHope）为主。20世纪初松萎蔫病首次在日本被发现，迄今为止该病已经引发了世界范围内严重的生态灾害和经济亏损。我国自1982年首次在南京发现该病以来，疫区范围很快蔓延扩大到15个省区，造成超过30万hm2松林死亡和200多亿美元的经济损失[2]，并且每年呈扩大蔓延

2、趋势，对我国的生态安全构成了严重威胁。因此，对松萎蔫病的研究和防治已经迫在眉睫[3-4]。松萎蔫病最主要的传播媒介昆虫是松墨天牛，它是一种危害松树的害虫之一。松墨天牛成虫羽化后取食松嫩枝补充营养时造成的伤口成为松材线虫入侵松树的主要入口[5-6]。雌性天牛成虫选择在生长较差或者因病枯萎死亡的松树上产卵，这样的循环过程中松墨天牛从幼虫化蛹羽化时就携带大量线虫，取食新鲜生命力旺盛的松树，而取食松枝补充营养时又将线虫“接种”到健康的树木上，导致病害的扩散蔓延。近年来，国内外对松萎蔫病致病机理进行了深入研究，该病主要涉及多方面因素，包括寄

3、主、松材线虫、媒介松墨天牛、蓝变真菌、伴生细菌以及环境因素，至今其致病机理尚未清楚。尽管综合的致病机制还未清楚，但对松萎蔫病的致病病原的研究从单一病原学说发展到线虫细菌复合致病假说。赵博光、郭道森等[7-9]从松材线虫体表分离得到细菌对松树具有致病性。袁为敏等人[10]首次发现线虫体内也存在细菌，这些细菌可能对线虫的致病性有一定影响。林间防治松萎蔫病采用了注射杀菌剂恶喹酸的方法，取得了很好的效果，这间接证明了松材线虫致病性与伴生细菌有关[11]。松材线虫在我国属于外来入侵生物物种，自然气候条件适合松材线虫的生长繁殖，由于我国松林面

4、积广，松属植物种类繁多，松材线虫寄主广泛，所以松萎蔫病对我国造成了严重的生态破坏和经济损失，并且传播扩散形势严峻，各级政府都非常重视松萎蔫病的预防和治理工作。目前针对松萎蔫病的防治有两方面途径，一是切断媒介昆虫的传播，采取放置天敌、诱捕天牛等方法控制种群数量和密度，二是直接对松材线虫采取措施，采用杀线虫剂杀灭线虫、熏蒸或者焚烧病死木清理松材线虫。但是这些防治措施都不能有效的从根本上防治松萎蔫病的蔓延，寻求新的方法和手段防治和控制松萎蔫病的形势依然很紧迫。1青岛大学硕士学位论文松萎蔫病的早期防治主要以化学农药为主，但化学农药通常具有

5、毒性或残留性，对人类及生态环境都会造成直接或间接的污染甚至毁坏，长期使用会造成生物对农药产生抗性。近年来，松萎蔫病的生物防治受到人们越来越多的重视，寻找内寄生或捕食性真菌、杀线虫微生物以及开发生防植物成为主要的方法途径，对杀线虫陆生植物提取物及微生物活性产物的研究早已开展起来并已有一些报道。鄢小宁等人[12]发现一株少孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)真菌，对线虫的捕食率达87%；王云等人[13]分离出一株北里孢属放线菌（Kitasatosporasp.strainC620），其发酵液对松材线虫60h内的校正

6、死亡率为81.5%；文艳华等人[14]研究了14种植物抽提物，其中毛鱼藤对松材线虫具有极强的杀灭活性。海洋微生物与陆栖微生物在生活环境及生活方式上有很大差异，依据生态学的应用原理，从不是病原松材线虫栖息地的环境中采样，可以提高寻找杀线活性高的物质的成功率[15]。由于海洋生态环境的多样性和特殊性，如高盐、低温、少氧、低营养、少光照等，海洋微生物有着区别于陆栖微生物的生命遗传背景和代谢途径，并且产生种类繁多、结构特殊，活性强而稳定的代谢产物。因此，从海洋环境中寻找结构新颖、具高生物活性的先导杀线虫化合物十分必要。目前，对于杀线海洋微

7、生物及其活性物质的研究已有一些报道。于洁等人[16]从49株细菌中筛选出一株典型海洋细菌产黑假交替单胞菌（Pseudoalteromonasnigrifaciens），其培养液处理松材线虫24h校正死亡率可达82%；雷敬超等人[17]从海洋放线菌中筛选出一株链霉菌（Streptomycessp.）菌株HA07011，并且菌株发酵液在稀释后对线虫的作用依然没有减弱；Meng等人[18]从52株海洋真菌筛选出了一株顶胞霉菌(Acremoniumsp.)，该菌株的发酵液有较强的杀松材线虫活性。这些研究说明海洋环境中存在较丰富的具有杀线虫

8、活性的微生物资源，可以利用海洋生境的优势从中寻找杀线活性强的菌株，并从海洋微生物代谢产物中开发高效，低毒的微生物源杀线虫剂。本文以从青岛近海域中分离得到的海洋真菌为研究对象，通过杀线虫活性测定筛选、鉴定出具有较高杀线虫活性的菌株，对菌株产生杀线虫活