鬼臼毒素衍生物zm对骨肉瘤细胞的抑制作用及机制研究

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1、河北医科大学硕士学位论文鬼臼毒素衍生物ZM对骨肉瘤细胞的抑制作用及机制研究姓名：王悦鹏申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：陈虹201203中文摘要鬼臼毒素衍生物ZM对骨肉瘤细胞的抑制作用及机制研究摘要目的：探讨由实验室合成的鬼臼毒素衍生物ZM对人源骨肉瘤细胞Hos在体外的作用效果及机制，为抗骨肿瘤药物研制提供理论基础。方法：1MTT法和SRB法检测ZM的体外抗肿瘤活性。MTT法和SRB法测定ZM在体外对各种肿瘤细胞(Hos、KB、KBv200、Hcla、BGC．823、MCF．7、SMMC．7721、HepG)及正常细胞(VEC

2、)的ICso或G150值。2光学显微镜、荧光显微镜观察ZM作用后Hos细胞形态结构改变。在对数生长期的Hos细胞中加入不同浓度ZM(1州、2州)，作用于细胞24h，Gicmsa染色后光学显微镜观察照相并保留结果。同法进行Hoechst33342荧光染色，以紫外光(340nto)激发Hoechst，荧光显微镜观察照相并保留结果。3琼脂糖凝胶电泳分析ZM对Hos细胞染色体DNA断裂的影响。在对数生长期Hos细胞，加入不同浓度ZM(1州、2I．dVl)作用24h后抽提样本DNA，于1．5％琼脂糖胶电泳，电泳完成后用凝胶成像系统照相。VP．

3、16(10pM)为阳性对照。4RT-PCR法检测不同浓度ZM(1脚、2vM)对Hos细胞bcl．2、bax、P53、P21、caspase．3、PCNAmRNA表达的影响。结果：1ZM的体外抗肿瘤作用。本课题通过MTT和SRB法实验发现ZM对多种肿瘤细胞均有较强的抑制作用，IC50范围在0．43pxnol／L---9．871amol／L之间，且对耐药细胞株KBv200也有抑制作用，IC50为6．674-0．22lmaol／L，具有抗多药耐药活性。但对正常细胞VECIC50高于50lmaol／L。同时，ZM对人骨肉瘤细胞(Hos)有较

4、强的抑制作用，其IC50为1．324-0．51肛mol／L。通过绘制药物作用Hos细胞6天的生长曲线，发现不同浓度ZM对Hos细胞的生长抑制作用显著，且呈现较好的量效关系。中文摘要2检测鬼臼毒素衍生物ZM诱导Hos细胞的凋亡的效果把不同浓度ZM(1lxM、2州)作用于Hos细胞，24h后收集细胞。分别用Gicmsa染料和Hoechst33342／PI荧光染料对细胞染色，前者能够将细胞核染为蓝紫色，胞浆染为粉红色。未加药组细胞的细胞核染色均一，结构完整且核浆比值较大；给药组的细胞能够看到细胞核的形态呈现出细胞凋亡典型特征：核膜皱缩，核

5、固缩，核碎裂。用Hoechst33342荧光染料对细胞染色，在紫外光的激发下可发出蓝色荧光，在荧光显微镜下观察能够看到Hos细胞发生凋亡的细胞形态变化。细胞核内染色质出现集聚、碎裂，细胞膜也不断地出芽并脱落，细胞亦碎裂为数个大小不同的凋亡体，伴随着ZM浓度加大，镜下这种具有特征性的形态学变化的细胞数目愈来愈多，凋亡的细胞比例亦逐渐增高，显示出明显的剂量依赖关系。在经典的DNA降解断裂检测实验中，用不同浓度ZM分别作用于Hos细胞24h，提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可呈现典型的“DNA梯子样”图谨喟0因此，综合以上可以认为鬼臼毒素新

6、衍生物作用于Hos细胞时能够诱导细胞的凋亡。3ZM对Hos细胞凋亡相关基因bcl．2、bax、P53、P21、caspase．3、PCNA表达的影响．本实验观察了ZM对凋亡相关基因bcl．2、bax、P53、P21、．caspase．3和PCNA的mRNA表达的影响。经不同浓度的ZM(1洲、2州)作用于Hos细胞244',时，RT-PCR结果显示ZM可上调bax、P53、P21、caspase3的mRNA表达，同时下调bcl．2和PCNAmRNA的表达，结果同对照组相比均有显著性差异(P

7、导细胞凋亡的作用极可能依靠上调促凋亡基因bax、P53、P21、caspase．3表达，同时下调凋亡抑制基因bcl一2、PCNAmRNA的表达，从而诱骨肉瘤细胞发生凋亡。结论：鬼臼毒素衍生物ZM的结构是实验室首次合成，并通过实验室体外实验，证明了其具有显著的体外抑制多种人源性肿瘤细胞生长的特性，对骨肉瘤细胞抑制作用也同样显著。根据实验结果推断，其通过诱导骨肉瘤细胞凋亡而减少细胞增殖，其机制可能是通过上调bax、P53、P21、easpase一3基因mRNA水平的表达量，下调bcl．2、PCNA基因mRNA水平的表达量而达到影响肿瘤细

8、胞的增殖与诱导凋亡的作用。中文摘要关键词：鬼臼毒素衍生物；细胞凋亡；骨肉瘤————————————————————————————————————一_一●3英文摘要Anti．HoscellsactivitiesofPodophyllo