鬼臼毒素衍生物z262抗多药耐药肿瘤细胞作用及机制研究

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1、fj’{f．～J目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4研究论文鬼臼毒素衍生物Z-26-2抗多药耐药肿瘤细胞作用及机制研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7月U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19附图⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54个人

3、简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55相并保留结果。同法进行Hoechst33342荧光染色，以紫外光(340nm)激发Hoechst，荧光显微镜观察照相并保留结果。3琼脂糖凝胶电泳分析Z。26．2对K562／A02细胞染色体DNA断裂的影响。在对数生长期KBV200细胞，加入不同浓度Z．26．2(1m'nol／L、2I．tmol／L)作用24h后抽提样本DNA，于1．5％琼脂糖胶电泳，电泳完成后用凝胶成像系统照相。VP．16(10I_tmol／L)为阳性对照。4流式细胞术分析Z．26．2对K5

4、62／A02细胞凋亡率及细胞周期的影响。对数生长期K562／A02细胞，加入不同浓度的Z．26．2(1I．trnol／L、2I．tmol／L)药物，分别作用12h、24h后用流式细胞仪检测凋亡率以其及对细胞生长周期的影响。5RT-PCR法检测不同浓度Z．26．2(1I_tmol／L、21．tmol／L)对K562／A02细胞mdr-1、p53、p21、caspase．3mRNA表达的影响。结果：lZ．26．2的体外抗肿瘤作用。本课题通过MTT和SRB法实验发现Z．26．2对多种肿瘤细胞均有较中文摘要强的抑制作用。IC5

5、0范围在0．681amol／L～15}tmol／L之间，对skov3的作用最明显，IC50值达到0．689mol／L。从SRB结果可看出：Z．26．2对人红白血病细胞(K562)及阿霉素诱导的多药耐药株(K562／A02)均有抑制作用，其G150分别为1．49rnol／L、1．6灿nol／L，对多药耐药细胞及其母本细胞均有较强的抑制作用。通过绘制药物作用K562／A02细胞6天的生长曲线，发现不同浓度的Z．26．2对K562／A02细胞的生长抑制作用显著，且呈现较好的量效关系。2鬼臼毒素衍生物Z．26．2不同浓度组对K

6、562／A02细胞周期的影响本文采用流式细胞仪分别检测不同浓度组的Z．26．2(1“mol／L、21xmol／L)作用12h$124h后对K562／A02细胞周期的影响。结果显示与空白对照组相比较，不同浓度的Z．26．2在12h、24h时间点都可将细胞周期阻断在S期。这说明Z．26．2作用12h、24h后，药物进入细胞核内，并将细胞阻滞于DNA合成期。3检测鬼臼毒素衍生物Z．26．2诱导K562／A02细胞的凋亡的效果把不同浓度的Z．26．2(1lamol／L、21amol／L)作用于K562／A02细胞24h后，分别

7、用Giemsa染液和荧光染料Hoechst33342／PI对细胞进行染色，前者将细胞核染成粉红色，胞浆染成蓝紫色。未加药组的细胞核染色均一、结构完整、核浆比值大；给药组细胞可见细胞核形态呈现细胞凋亡的典型特征：核膜皱缩，核固缩，核碎裂。用荧光染料Hoechst33342对细胞进行染色，在紫外光激发下发蓝色荧光，荧光显微镜下观察可发现K562／A02细胞凋亡的形态学变化。细胞核染色质发生聚集、碎裂，细胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的凋亡小体，伴随着z．26．2浓度的加大，镜下具有这种细胞形态变化的细胞数量愈加明

8、显，凋亡细胞的比例逐渐增加。并且鬼臼毒素新衍生物浓度的越高，细胞凋亡形态的变化愈显著，凋亡细胞的比例愈多，显示出明显的剂量依赖性。在经典的DNA降解断裂检测实验中，用不同浓度的Z．26．2分别作用于KBv200细胞24h，提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可呈现典型的“DNA梯子样"图谱。应用流式细胞仪进行肿瘤细胞凋亡率测定，可见经不