非诺贝特对大鼠局灶性脑再灌注损伤的脑保护作用

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1、损伤的重要分子成份fnJ．在上述提到的基础之上，我们进行体内研究，以评价非诺贝特药物干预与小K和ERK水平相应的变化有关．MAPK的表达水平决定于大鼠是否经过非诺贝特预处理。我们发现非诺贝特预处理会通过调整MPK的表达保护脑缺血再灌注损伤2．1实验设计选60只健康成年大鼠，体重220～250克，随机分为3组：假手糊n宅哦脑缺血再灌注组(R组，嗍O)；非诺贝特预处理组(IF∞)。非诺贝特预处理的大鼠再灌注之前给予n殛kg／d的非诺贝特混合在食物中喂养l4天。2．2大鼠脑缺血再灌注溪型的制作用线栓法制作大鼠大脑中动脉梗塞模型堋。用l∞6水合氯醛(03nd^【g)腹腔注射，约缸面后麻醉开始

2、起效，持续时问为1．5小时，仰卧位固定，切开颈正中切口。钝性分离颌下腺，在座恻的肩胛舌骨肌、胸骨舌骨月几之间用眼科平镊钝性分离出左侧颈总动脉(∞fIⅡ∞nc啪酗锄eIy，CcA)及其分支颈外动脉(既电m迸c暂。缸撕y，ECT)，颈内动脉(缸呱lai傀。融锄时，ICA)，避免损伤迷矗!神经、血管和颁下腺体背面的静脉窦。首先用6．o缝合线结扎CcA，将E(’A在分支出枕动脉和甲状腺七动脉处以6-0缝合线结扎，游离出E(、A主干；分离出_CA及其项外分支翼腭动脉并穿—套线，6．O缝合线结扎。解剖显微镜下用眼科剪在a：A主干匕方接近E(狐与_cA分叉处剪一小口，将尼龙线栓(尼龙线前端涂E一层

3、硅树脂，使其变粗，直径0．2锄．35H姐)沿切口插入至ICA后，缚紧i{fl戋处的接扎丝线，防I鹾劬蝴出出血，移去lCA上的动脉央，继续豫赫拦瞅向内推进2A啪左右，微遇阻力时停止，然后略向后退回I砌，此时线栓头端己j自立大脑中动脉(middk皑曲面绷ery，MCA)根部，进入为癌l；i『：动脉(锄时im嘧ebd咖，ACA)起始部，阻断了左侧MCA血流，此时可移去a2A的动脉央。2小时后，抽出栓线造成再灌注，将颌下腺归位，缝合皮肤。缝线包埋植，入皮肤，缝合皮肤。缺血2lI后再灌注酿，22h后盘b死。假手术组小鼠不插线阻断爱侧ICA，其手操作相同。各组动物术中均用加热板使其肛温维持在37

4、。c左右，术后单笼饲养。2．3脑梗死体积百分比测定再灌注挖h后，用l麟水合氯醛(30嘶眺g)深度麻醉，取出的脑组织立即放入冰箱，在珈忙放置20分钟后切成撕啪切片，将切片放入2％37℃氯化三苯四氮唑磷酸盐溶液中(PBS，PH7．4)37a

5、c恒温。避光孵育30分钟，最后放入加鲫多聚甲醛中，正常组织染廊昀睦I：色，梗刑&：染成白色．每个脑片用删A¨1000图像分析系统，测定梗死面积，梗死体积决定于每—切片梗死面积脑片的厚度，二者乘积为体积嗍。2．4神经功能缺损评分Ⅻ)s再灌注笼，J、时后。按IJ0l耐吗角削蛳神缬黼。分'矧槿擞揪l允不能伸展对懊蝴爪；2允彳亍j埘I句1釉藿铐转匾3允向偏鲫

6、碍愤隗4允不能自发行走怎识丧失．其中，O分及4分者被剔除．2．5脑组织含水量测定再灌注挖小时后，取出新鲜的脑组织，除去硬脑膜，小脑，脑于和嗅球以及残余的脑组织，血液被清除后，用电子秤称出重量．在烘干箱以l∞ac持续烘于24小时直至重量不再减轻为干重．根据(鼬’sfaInadl5l：脑组织含水量(％)=(湿重．千重)，湿重×100％2．6脑组织病理观察再灌注笠小时后，经湖龇200IIll盐椴40学『L甲醛(o．Oln曲oI／I，P髂，哪4)灌注，取脑，切成5n如，放入40蚺。甲醛中(59几Dl蛋c煨泡2小时，用酒精常规梯度脱水用二甲苯透明化燃包嘎切片4lI曲厚，贴在用笏锅麟处理过的玻璃

7、上光镜下观察所有的组织切片娜染色lmm德马组织浸入2％甲醛(含25酊)放置lg~24小时用PBs洗后逐步用5眠7眠00％90％酒精脱水，日伽12包埋，切片厚lm，然后超薄切片经醋酸铀及柠檬醋盐染色后，在JEM—1200E电子显微镜下观察。2．7nyNEL检测矾INⅡ．原装试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，切片经过脱腊，乙醇水化双氧水30分钟阻断内源盐辣根过氧化物，用蒸馏水洗3次，每次2分钟。在37℃蛋白激酶(加卯)中培养lO分钟，平衡液(核苷酸生物素，锰离子及T‘盯(末端脱氧核苷酸转移酶))室温370C2小时，11强洗涤，阻断液370C30分钟。清洗3次后，l：100过氧化物酶坛记的

8、地高辛370C30分钟，n粥7ac清洗30分钟。切片用DAB染色5-lO分钝镜下被染成核褐色者为11yNEI，阳性细胞为凋亡细胞，光镜200倍下选择6个具有代表性的视野计数lm酊阳性细睡L阴性对照用O．olr珊n，cPBS代替抗体．如果没有阳性细胞，说明—抗具有残1231的特异性。2．8免疫印迹法测定JNK和圆(的活性再灌注6小时后处死大鼠取出全脑分离出背侧海马约10嘶flg，乖l湮后，置组织于lIIll十字玻璃浆器中。加RmA0嘶ⅢⅪI／LTr酞躺．o】