大鼠局灶性脑缺血再灌后pao活性和多胺含量变化与意义

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1、硕士学位论文前言第一章：前言多胺是包括腐胺、精脒、精胺在内的直链带正电荷的多价阳离子碱性胺，广泛存在于生物体的各种组织细胞内，是一种重要的代谢调控物质，在细胞增殖分化中起重要作用。在生理条件下，多胺能通过其多价正电荷与带负电荷的DNA、RNA、核苷酸、蛋白质等生物大分子相结合，从而影响和调节其功能，发挥这些生物大分子的生物学功能，即表现为细胞的生长、分化和各种生命功能的表达“⋯。多胺的生物合成始于两个平行进行的脱羧反应，一是鸟氨酸(ornithine)在鸟氨酸脱羧酶(ODC)的催化下，脱羧生成腐胺(putrescine)；二是s一腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，S枷

2、经S一腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SA

3、IlDc)的作用下生成脱羧的s一腺苷甲硫氨酸(decarboxylatedS-adenosylmethioine，dc—SAM)。腐胺(putrescine)在精脒合成酶和精胺合成酶作用下，进一步生成精脒(spermidine)和精胺(spermine)；丽dcSNlIi则为精脒和精胺的合成提供氨丙基(_cmcH：C刚H2)。鸟氨酸及SAM是多胺生物合成的前体物质，精脒与精胺是多胺生物合成途径的主要终产物。真核生物另具有一套氨酰化、氧化降解系统，可逆向将精胺转化为精脒，并进一步将精脒转化为腐胺，这一途径称为“腐胺循环”，其意义在于调节细胞内多胺维持在恒定水平

4、。在此过程中有两个相关的酶参与，一是精脒／精胺-NL乙酰转移酶(ssAT)，二是多胺氧化酶(PAo)。前者将乙酰基转移至精脒及精胺的Nl位，生成N1_乙酰化精脒(精胺)，后者进一步作用于其内部N原子，生成有毒性的3一乙酰氨基丙醛及腐胺或精脒，同时产生大量的过氧化氢“’“1。近十年来大量研究表明多胺在脑缺血后血脑屏障的损伤、血管源性脑水肿的形成、以及再灌注性神经元损伤等病理过程中起重要的作用“。1⋯。其在多种病理条件下造成脑组织的损伤机理至少有以下五种途径““”：(1)多胺与NMDA或AMPA受体的多胺位点结合，开放钙离子通道，造成细胞内钙超载，同时伴钠离子内流增加，启动NOS系统，促进神经

5、末梢释放大量的兴奋性氨基酸；(2)多胺直接或间接启动磷脂酶A2一G蛋白激酶系统，启动各种合成酶，特别使多胺代谢酶合成增加，引起过氧化氢(H。02)自由基大量产生，加速了脂质过氧化，造成细胞膜性结构的损害；(3)由于多胺大量溢出细胞外间隙，致使NMDA和AMPA受体反应过度：(4)多胺在相互转变的过程中，由于精脒／精胺一NL乙酰转移酶和多胺氧化酶(PAO)的作用，产生了大量的过氧化自由基和3一氨基丙醛等毒性产物，引起细胞的凋亡：(5)多胺通过线粒体途径介导细胞的凋亡，造成触酶启动及凋亡的细胞死亡。硕士学位论文生物体内多胺水平的高低除了受其生物合成、乙酰化修饰所调节外，还受其氧化降解的影响。S

6、eiler和Bolkenius研究发现正常成年脑组织的腐胺水平仅仅30％来源于鸟氨酸脱羧反应，而70％来源于“腐胺循环”⋯1。因此，多胺氧化酶(PAO)作为腐胺循环过程中最后一步反应的关键酶对于多胺含量的调节有着重要的作用。本实验旨在应用改良的Longa线栓法复制大鼠大脑中动脉(酗CA)区局灶性脑缺血再灌注动物模型，并在此基础上用高香草酸荧光法测定脑缺血区皮质和皮质下不同时相多胺氧化酶(PAO)活性的变化；用高效液相色谱法测定脑缺血区皮质和皮质下不同时相多胺的含量，探讨其意义。2硕士学位论文材料和方法第二章：材料和方法2．1动物实验材料(1)SD清洁级健康成年雄性大鼠，体重250--350

7、9，由中南大学湘雅医学院动物学部提供。(2)手术显微镜，常规显微手术器械。(3)直径0．25mm尼龙线(日本进口)。(4)左旋多聚赖氨酸(Poly—L-lys／ne，武汉Boster生物工程有限公司)。2．2实验动物分组sD大鼠随机分成实验组和对照组实验组：采用改良的Longa线栓法，造成大鼠右McA缺血2小时，在再灌注2，4，8，24h后，检测MCA供血区皮质及皮质下PA0活性和多胺含量，每个时间段中的动物为5只。对照组：除了不栓塞血管外，余操作同实验组，其中每个时间段的动物为5只。2．3动物模型制作(附图1)采用改良的Longa线栓法建立右侧MCA局灶性脑缺血再灌注动物模型。大鼠术前禁

8、食12小时，不禁水，用10N水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量0．3-0．4ml／1009，追加剂量O．08—0．1ml／1009。麻醉成功后，取仰卧位，下垫纱布，用皮筋固定四肢及头部，鼠尾用胶布固定，置直肠温度计监测肛温，用加热垫和灯照使体温维持在37-38摄氏度。做颈部正中切口，从下颌骨至胸骨柄上缘，长约2．5至3厘米，分别切开皮肤，皮下，见下颌腺分布于两旁，钝性分离双下颌腺，左腺留于原位，用外科动脉瘤夹夹住右腺的尖端，用4