免疫实验-icc用细胞抗原的制备

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1、ICC用细胞抗原的制备_、材料和试剂1.0.01MPBS(pH7.4):NaCI8.0g;KCI0.2g;Na2HPO41.44g;KH2PO40.24g;ddH20至1000ml;高压灭菌,分装。2、0.25%胰:称取EDTA0.02gNaCI0.8gKCI0.04g加三蒸水100ml溶解后加0.25g胰酶，轻轻搅动，使胰酶溶解，不要产生泡沬，加酚红少许，调PH值到8.2-8.6M滤除菌，分装10ml/管厂20°C保存临用前预温到37°CO3、诱导液仃PA):12•邻•十四酰•佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-

2、acetate,TPA)溶于丙酮,配成20mg/mlo二实验步骤（一）、用96孔级胞培养板制备贴壁细胞抗原（正常贴壁细胞）1、HFF,NIH3T3细胞用含10%血清DMEM完全培养液在75cm2培养瓶中单层培养，使密度达到90%2、倾去培养液,用无菌PBS液5-10ml洗细胞一次，用无菌吸管吸干PBS液。3、加0.25%胰酶（从・20°C取出在37工预温）75平方厘米培养瓶加lml,37°C温箱或有经验者可在酒精灯周围，控制温度约37弋左右，轻轻摇匀使胰酶充分覆盖细胞表面。4、观察到细胞有松动，成流沙状下落;或在显微镜下观察，细胞已有收缩变圆时,用无菌PBS液

3、15・20ml,终止反应。5、轻轻吹打下细胞，使细胞单个分散，并充分混匀1500转/分离心5-10分钟，去掉上清液6、打散细胞，加10ml含血清DMEM完全培养液混匀，取10ul在显微镜下计数，计算细胞浓度。7、用含10%血清培养液调整细胞浓度至1x104个/lOOul,每孔（96孔）接种200ul（即2x104个细胞/孔）,37°CCO2培养箱培养。&次日显微镜下观察細胞是否完全贴壁（一般24小时可完全贴壁准9去培养0.01MPBS液先二次（孔中加满PBS,轻轻倒掉）并在滤纸上扣干仮复3次）应注意加液的力度，不能太大，以免冲掉细胞，倒去上清液在滤纸上扣干水份

4、，但保持细胞湿润。9、加90%冷丙酮固定，每孔200ul,5・10min摔去冷丙酮，用PBS洗三次扣干。10、在培养板上作好标记（细胞名称,制备时间）。11、保鲜膜封好,・70°C保存。（二）、悬浮细胞玻片法的抗原制备1、25平方厘米玻璃瓶用含10%血清的1640完全培养液培养BCBL-1细胞，密度达到80-90%2、加样枪充分吹匀细胞，收集于离心管中。3、1500转/分离心5・10分钟,弃去上清液。4、打匀细胞，用PBS洗二次，弃去上清。5、打匀细胞,加少量PBS液（根据肉眼观察细胞溶液的浊度估计）混匀，取少量在显微镜下计数，调整浓度，估算在玻片上每个细胞涂

5、片圈位（12圈）接种细胞1x104个。6、室温下干燥,然后加100%的冷丙酮室温固定3-5分钝PBST洗二遍。7、室温干燥作好标记然后放入玻片盒，玻片盒用塑料袋密封并放一袋防潮剂厂20°C保存，一个月内有效。（三）病毒感染细胞抗原的制备1、96孔培养的贴壁细胞的病毒感染及病毒抗原的制备1）未感染细胞接种到96孔板（方法见"悬浮细胞玻片法抗原制备"步）,并完全贴壁。2）摔去PBS液，加入少量病毒液（加入量由先做棋盘试验来确定浓度，或先测定病毒滴度而定，且病毒液用2%-5%血清DMEM完全培养液稀释），每孔50ul,摇匀,使充分覆盖细胞表面Z37°CC02培养箱培

6、养（MCMV感染NIH3T3HCMV感染HFF13）每天观察细胞形态变化，早期CPE为细胞肿胀，中期聚集,晚期则圆缩。4）当圆缩细胞达到10%-30%左右細胞层出现明显的病灶同时还有正常细胞未感染即可收获（一般情况下齐4天）。5）倒去上清（倒入有消毒液容器以防止污染环境）,用无菌PBS液洗2次（加满培养孔，倒掉，在滤纸上扣干）。6）倒去上清加90%冷丙酮室温固定5・10min,每孔200ul。7）摔去冷丙酮，用PBS洗三次，扣干。在培养板上作好标记（病毒抗原名称，制备时间等）。9）保鲜膜封好,・70°C保存。2、BCBL-1细胞的诱导和KSHV病毒抗原的制备<

7、1>BCBL-1细胞扩大培养,细胞密度达到50%<2>TPA（120酰佛波醇乙酸酯），每毫升培养液加40ug（TPA预先配成20mg/ml<3>诱导三天后，收集少量细胞进行ICC预实验。<4>KSHV阳性细胞达到10%-30%时，可做细胞涂片，阳性细胞>30%时可用于制备病毒细胞裂解液。<5>KSHV阳性细胞达到10%・30%时,即可收获细胞加样枪充分吹匀细胞收集于离心管中。<6>2000转/分离心5-10分钟,弃去上清液。<7>打匀细胞，用PBS洗二次，弃去上清。<8>打匀细胞,加少量PBS液（根据肉眼观察细胞溶液的浊度估计）混匀，取少量在显微镜下计数,调

8、整浓度，估算在玻片上每个细胞涂片圈位（