雷公藤甲素致大鼠横纹肌溶解实验探究

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1、雷公藤甲素致大鼠横纹肌溶解实验探究中药雷公藤药材及其制剂在临床广泛用于类风湿性关节炎、肾病综合征、银屑病、湿疹样皮炎及其他自身免疫性疾病的治疗，而雷公藤甲素(雷公藤内酯醇，triptolide,TP)是从雷公藤根皮中提取的一种具有松香烷结构的三环氧二菇内酯类化合物，具有多种生物活性［1］。现代研究表明，TP不仅有抗类风湿性关节炎作用，还有抗癌、抗排异、抗糖尿病肾病、抗足细胞损伤诱导肾病综合征、抗肺炎、抗脊髓损伤、抗帕金森氏病、抗溃疡性结肠炎、抗免疫性肠病以及抗人骨髓增殖性疾病等广泛的药理作用，其中尤以抗癌活性最为突出［2-7］o但其毒

2、不良反应也不容忽视，研究表明，TP存在明显的肝毒性、肾毒性、生殖毒性和心肌毒性［8］o本实验通过对TP干预后大鼠骨骼肌组织及血清生化指标的研究，探讨横纹肌溶解毒性的产生与TP的相关性，为临床安全有效使用雷公藤制剂提供其可能存在安全隐患的数据及依据，对避免横纹肌溶解(RL)相关的临床急诊事件的发生具有重要意义。1材料与方法1.1实验动物SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(180±20)g,清洁级，由浙江省医科院实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK（浙）2008-0233o动物饲养条件：温度（23±2）°C,自由饮食饮水，照明时间12h

3、/d,适应性饲养1周后进行实验。1.2仪器与试剂低温冰箱（日本三洋公司）；低温4°C离心机（ThermoScientific，德国）；LD-1001型电子天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）；SynergyHT多功能酶标仪（美国BI0TEK公司）；Olympus光学显微镜；透射电镜（HitachiTM-1000,荷兰）。雷公藤甲素标准品由中国药品生物制品检定所提供；大鼠肌红蛋白ELISA试剂盒（美国RB公司）；ZB3-CK-J肌酸激酶试剂盒、H16L-C018乳酸脱氢酶试剂盒均由杭州艾迪康医学检验中心提供。2.5%的戊二醛溶液，1%和

4、2%餓酸，0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）o1.3动物分组和模型制备40只SD大鼠随机（随机数字法）分为4组：健康对照组、高剂量组（4mg/kg）＞中剂量组（2mg/kg）及低剂量组（1mg/kg）,每组10只。各组灌胃给药前禁食12h,除健康组动物给予等量生理盐水灌胃以外，其余各剂量组动物按0.8ml/100g一次性给予高、中、低不同浓度药物。给药后24h、48h时，以剪尾法获取各组大鼠静脉血，于4°C,3000r/min离心15min分离血清，-20°C冷冻，以备生化指标检测。给药后48h取静脉血后将全部动物以10%水合氯

5、醛(1ml/kg)麻醉并处死，分离横切大鼠两侧后肢股外侧肌肉组织约0.5cm厚的组织块，一部分用10%中性甲醛固定以备病理检查；另一部分用2.5%戊二醛固定，以备透射电镜观察大鼠骨骼肌超微结构用。1.4指标检测1.4.1血清生化指标测定采用Olympus全自动生化仪测定大鼠血清肌酸激酶(CK)、肌肝(Cr)、乳酸脱氢酶(LDH)的质量浓度值。1.4.2肌红蛋白含量测定以酶联免疫分析法(ELISA)测定大鼠肌红蛋白(Mb)含量，采用双抗体夹心法测定，Mb的标准曲线为y=679.48x+49.428(R2=0.9972)，如图1所示。1.

6、4.3骨骼肌病理组织学检查分离的组织块以10%中性甲醛固定，石蜡包埋并切片，常规HE染色，光镜下观察。1.4.4骨骼肌超微结构观察分离的组织块在2.5%的戊二醛溶液中固定，经漂洗、娥酸固定、再漂洗、乙醇梯度脱水、包埋剂梯度渗透，70工加热，得包埋好的样品。经Reichert超薄切片机切片，柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min,即可在透射电镜下观察。图1肌红蛋白(Mb)的标准曲线1.5统计学方法采用SPSS11.5统计软件包处理，计量资料以均数土标准差（x±s）表示，组间比较釆用单因素方差分析（LSD-t法）。以P

7、0.05）；给药后48h时，各剂量组大鼠血清CK值均较给药24h时有所降低，与健康对照组血清CK值比较，差异无统计学意义（P>0.05）；各给药组大鼠血清Cr值与健康对照组比较，则无论在任何时间点差异无统计学意义（P>0.05）o见表lo表1各组大鼠给药后24h、48h时血清LDH、CK、Cr水平比较（n=10,x±s）注：与健康对照组比较，aPO.05）o见图2。与健康对照组比较，aP光学显微镜下观察可见，健康对照组大鼠的肌肉组织无明显病理改变；而用药后48h时大鼠肌纤维肿胀，周围可见少量的炎性细胞，横纹肌结构不清，细胞膜皱缩不光滑

8、，细胞核串联聚中。高剂量组大鼠肌纤维断裂呈鼠尾状，出现严重水肿及颗粒变性等病理改变。病理结果见图3。A：健康对照组；B：TP高剂量组；C：TP中剂量组；D：TP低剂量组图3给药后48h时各组大鼠骨骼肌病理组织学改变结果（