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1、药用真菌猪苓菌核渗出液理化性质探究［摘要］探讨不同发育阶段人工培养的猪苓菌核渗出液的理化性质。对药用真菌猪苓进行培养，系统地观察不同发育阶段的猪苓菌核及其渗出液的形态特征；对不同发育阶段猪苓菌核渗出液的pH进行测定；采用硫酸-苯酚法测定猪苓菌核渗出液的多糖含量；并利用BCA蛋白含量测定方法测定猪苓菌核渗出液的蛋白含量，利用紫外吸收法测定猪苓菌核渗出液中过氧化氢酶（CAT）的含量。在猪苓菌核发育过程中，菌核渗出液pH出现先升高后降低的趋势；渗出液的多糖含量逐渐下降；渗出液的蛋白含量及CAT含量出现逐渐升高的趋势，说明猪苓菌核渗出液形成过程中伴随着高
2、水平的氧化应激反应。添加维生素C以后，部分地消除了活性氧，因此CAT活力下降。猪苓菌核渗出液的pH在猪苓菌核形成过程中一直维持酸性状态，间接反应出酸性环境有利于猪苓菌核的形成；菌核渗出液具有逐渐产生且最终被菌核重新吸收的特征。［关键词］猪苓；菌核；渗出液；多糖；CAT［收稿日期］2013-07-07［基金项目］国家自然科学基金项目（31201666）；国际科技合作项目（2011DFA31260）［通信作者］*郭顺星，研究员，博士生导师，研究方向为药用植物菌根生物学，Tel:(010)62829619,E-mail：sxguol986@163.co
3、m［作者简介］邢咏梅，博士，助理研究员，研究方向为药用真菌学，Tel:(010)62819871,E-mail:meimary@163.com猪苓Polyporusumbellatus(Pers.)Fr.是一种珍贵的药用真菌。猪苓的药用部位是菌核，用于治疗水肿、急性肾炎、尿频尿急、黄疸以及腹泻等疾病［1-4］。然而，随着猪苓药用范围的扩大，加上野生猪苓资源的商业采挖，导致野生猪苓资源濒临枯竭。目前，人工栽培猪苓存在菌核生长缓慢，需要以天然猪苓菌核作为种苓等缺点，严重制约了猪苓的大面积栽培。本实验室在以往的研究中发现，人工培养的猪苓菌核与天然猪苓菌
4、核特征性化学成分的指纹图谱基本一致，具有潜在的应用价值［5］。然而，许多研究者致力于植物病原菌菌核生理生化特性的研究，而对于药用真菌菌核的研究报道较少。本研究对人工培养的猪苓菌核渗出液的理化性质进行研究，为猪苓菌核形成的生理过程提供重要的理论依据。1材料本实验所用猪苓采自山西古县北平镇党家山村，由中国医学科学院药用植物研究所郭顺星研究员分离鉴定，保存于麦魏琼脂培养基。麦芽糖，K2HP04,KH2P04,MgSO4・7H20,维生素B1,除菌滤器，微孔滤膜（孔径0.22um,直径13mm）,琼脂粉等购自北京科百奥生物科技有限公司。NovagenBC
5、AProteinAssayKit购自默克公司，过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。培养基：麦芽糖20.0g,K2HP041.0g,KH2PO40.5g,MgS04・7H200.5g,琼脂粉15.0g,去离子水1Lo2方法常规高压灭菌后冷却至60°C左右，0.05g-L-1维生素B1通过0.22um微孔滤膜加入到灭菌后的培养基中，充分混匀后于直径9cm的培养皿中倒平板，每个平皿倒入20mL培养基[2,5]o维生素C（VitC）添加组在分装培养基前，将维生素C通过0.22um微孔滤膜加入至培养基中配制成终浓度为0.5g•L-1的
6、溶液后再倒平皿，每个平皿倒入20mL培养基。2.1观察猪苓菌核渗出液形成情况随着培养时间的延长，观察猪苓菌核的形态特征及渗出液的产生，并在菌核发育的不同阶段收集猪苓菌核渗出液，置-80£备用。2.2猪苓菌核渗出液的pH测定取猪苓菌核发育不同阶段（30,50,70,80d）的菌核渗出液，以MettlerToledopH计测定其pH。每个样本重复3次，该实验重复3次。2.3猪苓菌核渗出液多糖含量的测定精确称取无水葡萄糖（105工干燥至恒重）10mg置10mL量瓶，加去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精确吸取上述溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0
7、.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.OmL于具塞试管中，加去离子水1mL,加6%苯酚溶液1mL,加浓硫酸5mL,混匀，置沸水浴中加热15min,取出后立即置冰水中冷却30min,在490nm波长处分别测定吸光度。绘制标准曲线，求出回归方程。精密量取不同培养时间的猪苓菌核渗出液lmL,以氯仿、丙酮抽提除色素，以石油瞇除酯。加入8mL石油瞇，充分混匀，4500r•min-1离心10min后，弃上清，加5mL去离子水，混匀，超声提取30min,4800r-min-1离心10min,弃上清，药渣60I干燥后转至50niL具塞三角瓶，加去离子水20m
8、L,80°C水浴3h,抽滤，弃药渣，上清液定容至25mL,精密吸取1mL,置10mL离心管，加无水乙醇4mL,4°C存放过液。4800r
