rna干扰沉默stat3基因对tgf-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响及其机制研究

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1、新乡医学院硕士学位论文RNA干扰沉默STAT3基因对TGF--β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响及其机制研究姓名：夏武申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：刘巨源201204新乡医学院硕士学位论文IⅢA干扰沉默S仉玎3基因对TGF．p1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响及其机制研究摘要背景肺纤维化(PulmonaryFibrosis，PF)是初期表现为肺泡炎症，随后炎症、细胞因子和生长因子等多种因素导致肺组织的异常修复，表现为肺间质细胞增殖，分泌大量的细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)在肺泡腔内沉积，最终导致肺结

2、构不可逆重构的疾病。成纤维细胞(Fibroblast，FB)向肌成纤维细胞(Myo舫roblast，MB)转化是PF的发展的关键环节。MB特征性表达O【．平滑肌肌动蛋白(Cc．SmoomMuscleActin，Ⅸ一sMA)，是合成胶原和ECM的主要细胞并与ECM的沉积有关。转化生长因子．6l(Transfo硼ingGrowthFactor-pl，TGF．p1)可以诱导FB向MB转化，是关键的致纤维化因子。信号转导和转录激活子3(Si盟alTransducersandActivatorsofTrans函ption3，Sn盯3)是细胞内重要的转录调节因子，它可

3、被多种细胞因子和生长因子激活，活化的STAT3进入核内调控靶基因转录，调节机体生理和病理过程。S丑盯3在肺纤维化中的作用尚未阐明。目的构建表达RNA干扰片段的质粒沉默STAT3基因表达并研究沉默S仉町3基因对TGF—Bl诱导的FB向MB转化的影响及作用机制，为PF新药的丌发和临床治疗奠定理论和实验基础。方法合成针对STAT3mRNA的2条短发夹DNA和一一条作为阴性对照的sTAT3mRNA非同源序列DNA，分别插入pSilencer丌Ⅵ4．1．CMvneo质粒构建表达RNA干扰片段的重组质粒SiRNA．ST3—1，2，N。HFL．I细胞培养至对数生长期，所

4、有实验均采用5．7代细胞。5“g·L。1TGF．pl刺激0h、6h、12h、24h、48h、72h后，ImPCR法检测C011agen—III、S曰汀1、PIASl、STAT3和PIAS3mRNA表达，刺激0d、1d、3d、5d后，WestemB10t法检测STATl、STAT3和pSllAT3蛋白表达。SiRNA表达新乡医学院硕士学位论文质粒转染治疗分为6组，正常对照组组(Bc)；5“g·L。1TGF．pl组(T)；转染试剂组(NC)；SiRNA—ST3-N质粒组(SN)；5岭·L‘1TGF-pl+SiRNA-ST3-1质粒组(S1+T)；5“g·L-1

5、TGF．p1+SiRNA．ST3—2质粒组(S2+T)。TGF．p1与转染质粒同时加入。24h和48h后，RT．PCR法检测各组细胞中仪．SMA、Collagen-I、Collagen-III、S卫钮1、P认S1、S丑盯3、PIAS3mIⅢA表达，westemblot法检测各组细胞中0【．SMA、Collagen．I、Sn订1、Sn盯3和pSTAT3蛋白表达。结果1．重构质粒SiRNA—ST3—1，2，N测序结果与设计相符，SiRNA．ST3．1，2转染TGF．D1诱导HFL．I后能有效抑制S丑盯3mRNA和蛋白表达。2．HFL．I细胞经5¨g·L’1TG

6、F—pl诱导后，Collagen。III和STAT3表达均明显上调(尸

7、达明显下降(P

8、—————————一Ef．fetsofSilencingSTAT3