jnk1基因沉默对肺成纤维细胞增殖影响

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1、温州医学院硕士学位论文目录一、缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··(4)二、中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··(5)三、英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··(7)四、前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(9)五、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1O)六、结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(22)七、分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(29)八、结论及今后研究方向⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·(31)九、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··(32)十、个人信息⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··(34)十一、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·(35)十二、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·(36)十三、学位论文独创性声明⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯··(43)温州医学院硕士学位论文英文缩写缩略词表英文全称中文译名CCK‘‘8CellCountingKit——8细胞增殖／毒性检测试剂DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二已酯Dimethylsulphoxide二甲基亚砜DMEMDulbecco’SModifiedEagleMedium达尔伯克氏改良伊格培养基ECMExtracellularmartrixCarboxyfluoresceinC-junN-terminalkinaseLipoLipofectamineMAPK细胞外基质羧基荧光素c—jun氨基末端激酶脂质体Mitogen

3、—activatedproteinkinase促分裂素原活化蛋白激酶nmol／LRNAiRNAinterferenceSiRNASmallinterferingRNATBSTriSHClbufferTriSTrisamine纳摩尔每升核糖核酸干扰小干扰核糖核酸分子三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液三羟甲基氨基甲烷4温州医学院硕士学位论文JNKl基因沉默对肺成纤维细胞增殖的影响研究生：林蓓蓓导师：李昌崇教授张维溪副主任医师林立主治医师温州医学院附属第二医院、育英儿童医院呼吸内科中文摘要目的阐明J附K／SAPK信号通路介导肺成纤维细胞在哮喘气道重塑中的作用，研究C-Ju

4、n氨基末端激酶l(JNKl)基因沉默对总JNK蛋白水平表达、JNK蛋白磷酸化及人胚肺成纤维细胞(MRc一5)增殖的影响，深化哮喘发病机制理论，提供RNAi应用于哮喘防治的新靶点。方法设计针对JNKl基因的小RNA分子(siRNA)，以脂质体(1ip02000)转染法将双链siRNA转入MRC一5细胞后，设定转染siRNA浓度分别为0、20、30、50、100、200nmol／L，用流式细胞术测定转染效率，得出针对iRE-5细胞的最佳转染浓度。实验分空白对照组，脂质体(1ipo)组、JNKI-siRNAl组、JNKI-siRNA2和无关序列(NC—siRNA)

5、组，以最佳浓度转染细胞，用RT-PCR检测JNKlmRNA表达变化。取沉默效果较好的siRNA转染细胞并设置空白对照组、脂质体组、无关序列组，用Westernblot检测总JNK、磷酸化JNK(P-JI怄)蛋白表达，用CCK-8法检测siRNA对MRC-5细胞增殖的影响。结果1．流式细胞术检测最佳转染效率分别用浓度为0、20、30、50、100、200nmol／LNC-FAM-siRNA转染细胞后，细胞内带有荧光的细胞占总细胞计数的百分比分别为0、66．1％、76．5％、89．5％、87．6％、84％。结果表明转染MRC一5细胞的最佳siRNA浓度为50nm

6、ol／L，浓度小于最佳转染浓度时，转染效率随浓度的增加而增加，大于最佳浓度后，增／JHsiRNA浓度不会增加转染效率。2．RT-PCR法检测JNKlmRNA相对表达量RT—PER结果显示，各组的JNKlmRNA表达量分别为：空白对照组(0．674±0．131)、lipo组(0．658±0．112)、siRNAl组(0．337±0．059)、siRNA2温州医学院硕士学位论文组(0．410±0．069)、NC—siRNA组(0．645±0．125)。siRNAl组和siRNA2组的JNKlmRNA表达量均明显低于空白对照组、lipo组和无关序列组，差异有统计学

7、意义(尺0．05)。设计合成的siPJqAl和siRNA2经lip02000介导转染入MRC-5细胞后均可有效抑制目的基因JNKl的表达，抑制率分别可达到52．8％和49．9％，siRNAI的沉默率较siRNA2高，二者差异无统计学意义(乃O．05)。3．Westernblot法检测细胞总JNl【和P—JNl【蛋白的相对表达量／NKl一siRNAI组的总JNK蛋白表达水平低于其他三组，JNKI-siRNAI组(3．540±0．210)，空白对照组(5．433±0．311)、lipo组(5．515±0．353)、NC—siRNA组(5．482±0．296)，差

8、异有统计学意义(尺0．05)。JNKI-siRNAI