黄瓜rubisco活化酶基因(csrca)过量表达效应

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1、山东农业大学硕士学位论文黄瓜Rubisco活化酶基因（CsRCA）过量表达效应姓名：刘培培申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：艾希珍20120611山东农业大学硕士学位论文中文摘要黄瓜(CucumissativusL．)是我国主要的设施蔬菜，属于冷敏感和喜光植物。核酮糖-l，5．二磷酸羧化酶／力口氧酶(Rubisco)是光合碳循环的关键酶，对整个光合作用起重要的调节作用。虽然Rubisco在植物体内的含量很高，但它的催化效率却很低，在植物体内的活性受Rubiseo活化酶(RCA)的调节和控制。因此通过基因工程

2、手段，克隆RCA基因并进行遗传转化，对从分子水平上探明RCA基因过量表达对黄瓜生长发育及光合作用等的促进效应具有重要意义。本试验用农杆菌介导法将Rubisco活化酶(RCA)基因CsRCA导入黄瓜，分别用PCR、real-timePCR和Western杂交法进行分子检测，分析转基因植株的表达量。探讨CsRCA过量表达效应。研究结果如下：1．CsRCA正向插入植物表达载体pCAMBIAl301的CaMV35S启动子和NOS终止子之间，成功构建CsRCA的正义表达载体。2．构建了原核表达载体pET-CsRCA，并在大

3、肠杆菌BL21(DE3)plysS中诱导表达。以诱导蛋白免疫小白鼠，制备抗血清。测得效价为l：100，可以用于黄瓜中RCA蛋白的免疫分析。3．建立了高效稳定的黄瓜遗传转化体系。确定了黄瓜再生率最高的外植体部位为子叶节。筛选出了黄瓜遗传转化的最佳芽诱导培养基(MS+2．5mg·L一6-BA+0．5mg·LdABA+2mg·LdAgN03)和最佳伸长生根培养基(MS+0．2mg·L～KT+0．5mg·L。1IAA)：并确定了抗性选择的最适潮霉素浓度(5～10mg·L以)。4．利用农杆菌介导的叶盘法将pCAMBLAl3

4、01．CsRCA导入黄瓜自交系‘08．1’，获得7株具有潮霉素抗性的转基因黄瓜植株j拷贝数均为2(非转基因黄瓜植株的拷贝数为1)，转化率约为3．5％。表达分析结果表明，7株TO代转基因植株叶片的CsRCAmRNA表达量为野生型(WT)的1～I．98倍，在蛋白水平的表达信号显著强于WT的。5．4月17日测定(晴天)，转基因黄瓜在日光温室条件下的光合速率(Pn)和CsRCAmRNA相对表达量日变化均呈单峰曲线型。随着光量子通量密度(PFD)和气温(Ta)的升高而增加，12：00达到高峰，且CsRCA表达量与Pn的日变

5、化趋势一致，说明CsRCA参与日光温室黄瓜光合日变化。6．Tl代转基因植株的叶片叶绿素和类胡萝卜素含量、Pn及可溶性糖和淀粉含量均显著高于wT的；株高、叶面积、干物重也明显大于WT：初花期比WT提早l~4d，黄瓜Rubisco活化酶基因(CsRCA)过量表达效应且初期雌花／雄花大于WT。7．低温可使黄瓜幼苗叶片的CsRCA表达量显著降低，Pn、气孔导度(GS)明显减小，胞间C02浓度(Ci)升高。随胁迫时间的延长，暗下最大光化学效率(Fv／Fm)、光下实际光化学效率*PSII逐渐降低，而Fo逐渐升高，说明低温下P

6、n下降的主要原因是非气孔限制，24h低温胁迫对PSII反应中心产生不可逆伤害。与WT相比，转基因植株的CsRCA表达量、Pll、Gs、mPSII、Fv／Fm的降低幅度和Ci、Fo增加幅度较小，说明CsRCA过量表达可减轻低温对黄瓜幼苗光合机构的伤害，维持相对稳定的光合作用。8．低温下黄瓜幼苗叶片的丙二醛(MDA)含量显著增加。毗4h范围内，超氧物歧化酶(SOD)活性先快速升高，后缓慢降低；过氧化物酶(PoD)活性逐渐增加，而过氧化氢酶(CAT)活性逐渐降低；抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性先降低，后升高：抗坏血酸

7、(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量呈上升趋势。与WT相比，转基因株系的MDA含量始终较小，SOD、POD、CAT、APX活性和AsA、GSH含量显著增加，表明CsRCA过量表达可增强黄瓜幼苗的活性氧清除能力，维持膜结构的稳定，提高黄瓜的耐冷性。关键词：黄瓜，核酮糖一1，5一二磷酸羧化／加氧酶(Rubisco)；Rubiseo活化酶(I配A)：基因；过表达；光合作用：低温Ⅱ山东农业大学硕士学位论文OVer-expressionEffectsofRubiscoActivaseGene(CsRCA)inCucumber

8、AbstractCucumber(CucumissativusL)isanimportantcold-sensitivevegetablecultivatedinsolar-greenhouse．黜bulose·l，5-bisphosphateearboxylase／oxygenase(Rubisco)isakeyenzymeinthephotosyntheticcarb