黄金梨acc氧化酶基因过量表达载体构建及其拟南芥突变体验证

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文黄金梨ACC氧化酶基因过量表达载体构建及其拟南介关变体验证学位申请人：高立杰指导教师：张玉星教授石海燕副研究员学科专业：园艺产品质量与安全学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月七日独创性声明本人声明所朵交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文屮不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志

2、对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：3签字曰期：年广月（^曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内奔编入有关教抿度讲忏检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）签字日期：年()月签子曰期:>斤年〈月》tl分类号:S661.2单位代码:10086密级:公开学号:2012250黄

3、金梨ACC氧化酶基因过量表达载体构建及其拟南芥突变体验证ConstructionofACCoxidasegeneover-expressionvectorinwhangkumbaeandidentificationofArabidopsismutants学位申请人：高立杰指导教师：张玉星教授石海燕副研究员学科专业：园艺产品质量与安全学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月七日摘要黄金梨（Pyruspyrifoliacv.Whangkeumbae）属砂梨系统，为我国主栽品种之一。黄金梨果实质优味美，但其货架期短，采摘后

4、在常温条件下贮存易失水、黑心及腐烂，极大地影响了其采后品质。本研究以黄金梨果实为材料，依据已经公布的黄金梨果实PpACO1基因序列（基因登录号：JN807390），从黄金梨果实中克隆得到PpACO1基因，并以其作为目的片段，采用较为常用的植物表达载体pBI121构建了CaMV35S::PpACO1过量表达载体；同时以从拟南芥生物资源中心（ArabidopsisBiologicalResourceCenter，ABRC）购入的AtACO2基因缺失拟南芥为材料，用三引物法验证其突变体的纯合性，并用得到的ataco2纯合突变体拟南芥(以下简称at

5、aco2突变体)为试材，以哥伦比亚野生型拟南芥（以下简称Col-0）为对照，研究了ataco2突变体与Col-0的表型及生理差异。黄金梨ACC氧化酶基因过量表达载体的构建及其拟南芥突变体的验证为研究黄金梨ACC氧化酶基因功能奠定基础，并为利用分子生物学手段改良黄金梨果实的耐贮性、改善其采后品质提供参考依据。主要研究结果如下：1设计并合成正向引物ACO1-F和反向引物ACO1-R，用RT-PCR的方法从黄金梨果实的cDNA中克隆得到PpACO1基因编码区全长。2设计并合成分别带有XbaⅠ和SacⅠ酶切连接位点的正向引物ACO1-EF和反向引物

6、ACO1-ER，以PpACO1基因全长为模板扩增得到目的片段，并用TA克隆将该片段克隆到pMD19-T载体上。用XbaⅠ和SacⅠ将目的片段从T载体克隆产物上切下，并用T4DNA连接酶将其连接到用XbaⅠ和SacⅠ双酶切的植物双元表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游。通过PCR及双酶切鉴定其正确性，将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，通过测序及序列比对证明PpACO1基因已成功插入，CaMV35S::PpACO1重组过量表达载体构建成功。2从ABRC购入拟南芥AtACO1、AtACO2基因T-DNA插入突变体，用三引物法验证得到了拟

7、南芥AtACO2基因T-DNA插入纯合突变体。3Col-0与ataco2突变体的表型研究表明，AtACO2基因的缺失延缓了种子萌发、减弱了“三重反应”、使莲座叶直径显著减小、推迟开花且使花期延长。4通过研究Col-0与ataco2突变体中超氧物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、多酚氧化酶(Polyphenoloxidase,PPO)、脂氧合酶(linoleate:oxygenoxidoreductase,LOX)五种酶的活性发现，at

8、aco2突变体叶片中SOD的活性显著升高和PPO的活性显著降低；花中POD和CAT以及LOX的活性显著降低；果实中POD和CAT的活性显著升高，SOD和PPO的活性显著降低。关键