骨髓源性内皮祖细胞移植在肝纤维化大鼠肝内的示踪研究

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1、河南大学硕士学位论文骨髓源性内皮祖细胞移植在肝纤维化大鼠肝内的示踪研究姓名：刘冉申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：于静201205摘要目的肝纤维化的迁延病情使其在功能件HT细胞相对减少的同时，存在细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的过度沉移{，从而导致盯矣状隙的缩窄、肝小血管的闭塞，促进向肝硬化进展。而Il前公认，内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)能参与血管的新生和修复。但日前大多数学者均基于健康骨髓或外周m获得EPCs，从疾病个体能否获得正常EPCs的研究甚少，从而限制了自体细胞移植的临床应用。本研究拟针对肘

2、纤维化人鼠，对其骨髓源性EPCs的分离、诱导和培养，尝试为自体细胞移植治疗肝纤维化提供良好的供体细胞，并建立PKIl26荧光标记的肝纤维化人鼠骨髓源性EPCs的方法，观察其移植后在肝纤维化大鼠肝内的迁移和分化情况。旨在为治疗肝纤维化的临床J；v．Hj提供理论依据和实践基础。方法应用IJq氯化碳(carbontetrachloride，CCl4)皮下注射建立毒物诱导型肝乡下维化火鼠模型，通过密度梯皮离心法从肝纤维化人鼠骨髓巾分离单个核细胞，并JT】著速贴壁培养法进行体外诱导培养成EPCs；流式细胞仪检测其表型和纯度，乙酰化低密度脂蛋白和结合荆丽凝集素双荧光染色鉴定其吞噬功能，血管腔形成

3、实验鉴定其成血管功能。PKH26荧光体外标记EPCs，通过激光共聚焦显微镜、流式细胞分析仪等柃溯JPKH26荧光标记率，观察荧光标记对细胞生长状态的影响；将PKH26荧光标记的内皮祖细胞经尾静脉移植入肝纤维化大鼠体内，观察其在肝内的迁移示踪情况，并用免疫荧光法检测内皮细胞标志物CD3l和血管性假血友病因子(yonwillebrandfactor，vWF)的表达。评价外源性EPCs在肝纤维化体内向内源性血管壁迁移的倾向性。结果通过密度梯度离心分离法及差速9lIIi壁培养法，能从盯纤维化大鼠竹髓细胞中成功诱导并分化为具有特征件表型和功能的EPCs。细胞培养14天后呈现铺路石样结构；63．

4、9％的EPCs为CDl33NEGFR2双阳性细胞；EPCs具有成熟内皮细胞的吞噬功能，并能形成稳定的JflL管腔样结构。应用PKH26荧光标记的细胞呈红色荧光，标记ljfl性率为96．65％；标记细胞生长状态良好，同末标记细胞卡兀比，生长曲线无明显改变；PKH26标记的EPCs经尾静脉移植入肝纤维化大鼠体内后，可顺利迁移并种植于肝脏，并且这些细胞主要聚集于沿纤维分布的血管内皮和肝小叶内的寞内皮，并表达内皮细胞特异性抗原CD31和vWF。提示外源性EPCs有向内源性血管肇迁移的倾向性，从而为血管的修复和霞构奠定了基础。结论通过密度梯度离心分离法及差速贴壁培养法，肝纤维化大鼠骨髓细胞能被

5、成功诱导ji：分化为具有特征性表型和功能的EPCs。利用PKH26町在体外成功标记肿纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞，该细胞在移植入片f纤维化大鼠体内后，．口J‘迁移至肝内血管周围并向成熟内皮细胞分化。关键词内皮祖细胞，细胞移植，PKH26，示踪，肝纤维化ABSTRACTOBJECTIVEProtracringpathogeneticconditionofhepaticfibrosiszwillcausefunctionalhepatocytes，decreasingre

6、atively．andmeanwhileleadtOoverlydepositingofextracellularm

7、atrix(ECM)，itwilIcause响rroWofsinusoidalshapegapan．_．_docclusionofsmallhepaticVa5cuJar,p：omoy．曼hepa‘。ccirrhosis．Cu丌enllystudieshaveindicatedthatendothelialprogenitorcells(EPCs)caD．participateinVe55e15ofnewbomandrepalr．However'EPCsarealmostisolatedbyhealthybonemarroworperipheralbloodnow,ve∥fewtos

8、tudywhetherEPCscouldgetfromdiseasesindividual，therebytheclinicalapplicationofautoIogousceIItransplantationislimited．Here，wetakeliver-fibrosisratsasstudyobject，isolating，inducingandt髓iningtotheirbonemarrow．derivedendothelialprogeni