镉经内质网应激途径诱导鸡肝细胞凋亡机制的研究

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1、东北农业大学硕士学位论文镉经内质网应激途径诱导鸡肝细胞凋亡机制的研究姓名：邵成成申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：徐世文2012-06-20摘要镉是一种环境化学污染物，可通过水、空气和土壤的污染在动植物体内蓄积，而肝脏是体内最初镉积累和产生毒性部位，镉对动物肝脏的毒性作用可引发细胞内质网应激。内质网应激已成为国外研究的热门，但镉对肝细胞损伤机制的研究较少，尤其是关于镉致禽类肝细胞内质网应激诱导凋亡相关研究未见报道。本实验应用分子生物学技术克隆内质网应激标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因，利用基因工程技术在原核表达系统中表达了GRP78蛋白并制备出了多克

2、隆抗体；而后以鸡肝细胞为研究对象，在培养体系中分别加入终浓度0、2．5、5、10、20gmol／L氯化镉(CdCl2)，作用24h，通过对鸡肝细胞活性、细胞凋亡、DNA损伤、细胞内游离钙浓度、GRP78蛋白表达量及GRP78、GRP94、CaM、Bak、Bcl．2和Caspase．3mRNA表达水平等方面的检测，探讨镉致鸡肝细胞内质网应激诱导凋亡的机理。研究结果表明：1利用原核表达载体表达融合蛋白免疫新西兰白兔，成功制备出抗鸡GRP78的多克隆抗体。2应用MTT比色法首次测定了染镉24h鸡肝细胞的半数抑制浓度(IC50)为15．59+0．89gmol／L，表明镉对鸡肝细胞有

3、毒性作用；3倒置显微镜下观察不同生长时期鸡肝细胞生长情况，AO／EB双荧光染色、DNALadder检测不同浓度CdCl2对鸡肝细胞的影响，结果证实CdCl2可诱导鸡肝细胞发生凋亡，且凋亡具有剂量依赖性；4应用Fura-3／AM荧光指示剂测定染镉后鸡肝细胞内[Ca2+】i升高，CaM基因mRNA表达量降低，钙稳态发生紊乱，证实钙稳态失衡在镉致鸡肝细胞内质网应激诱导的凋亡中起作用。5westernbolt检测GRP78蛋白表达量，实时定量PCR法检测GRP78和GI心94mRNA表达量，结果证实GRP78蛋白表达量和mRNA表达量都随染镉剂量升高而增多，GRP94mRNA表达量

4、也呈剂量效应关系，证实GRP78和GRP94对肝细胞的应激有保护作用。6实时定量PCR法检测Bak、Bcl．2和Caspase．3mRNA表达量，Bak和Caspase．3mRNA表达量增多，Bcl．2降低，证实CdCl2可诱导鸡肝细胞凋亡。综上所述，本试验从细胞形态、细胞凋亡、细胞钙稳态、细胞内质网应激和细胞凋亡相关基因表达等几个方面，阐明了CdCl2毒性引起鸡肝细胞内质网应激并诱导细胞凋亡的机制。关键词：氯化镉；鸡；肝细胞；内质网应激；凋亡AbstractTHERESEARCHESONENDOPLASMICSTRESSRELATEDAPOPTOSISOFCADMIUMO

5、NCHICKENHEPATOYTESCadmiumisakindofenvironmentalchemicalpollutant，itiSaccumulationinanimalandplantthroughwater,airandsoilwhichwaspollutedbycadmium．AndliverWastheinitialpartofcadmiumaccumulationandtoxicityproduceinthebady．Cadmiumhadatoxicityeffectofliverinanimals，whichcouldinduceendoplasmicr

6、eticulumstressincell．ResearchofendoplasmicreticulumstressWasahottopicinforeigncountry，butresearchabouthepatocytesinjuriesofcadmiumWasrare，especially,researchonendoplasmicreticulumstressrelatedapoptosisinpoultryhepatocytesinducedbycadmiumhasnotbeenstudied．Inthisstudy，CodingsequenceofGRP78ge

7、neWasclonedbythemethodsofmolecularbiology．GRP78wasexpressedinprokaryoticsystembygeneticengineeringtechnology．ThepolyclonalantibodyWaspreparedusingexpressedfusionprotein．Chickenhepatocyteswastakenasamodel，cultivatedintheWilliams’Efor24hwiththefinalconcentration