连翘根醇提物抗肿瘤及免疫调节作用的实验研究

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1、河北医科大学硕士学位论文连翘根醇提物抗肿瘤及免疫调节作用的实验研究姓名：颜晰申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：单保恩；艾军201203中文摘要连翘根醇提物抗肿瘤及免疫调节作用的实验研究摘要目的：研究连翘不同部位(根、叶、果)提取物对食管癌细胞增殖的影响，筛选出作用效果最显著的部位；观察连翘根醇提物(ethanolextractofForsythiasuspensaroot,FSEER)诱导TE．13细胞凋亡的作用，并从基因及蛋白水平探讨其作用的分子机制；分析FSEER体内免疫调节活性，为其作为抗肿瘤新药开发提供参

2、考依据。方法：1分别制备连翘根、叶、果的水提物(FSWER、FSWEL、FSWEF)和醇提物(FSEER、FSEEL、FSEEF)；采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测六种连翘提取物对食管癌细胞(TE．13、TE．1、Yes．2、Eca．109)增殖的影响，计算对细胞增殖的抑制率，并在光镜下观察细胞形态变化。2MTT法检测不同浓度FSEER(O．3、0．4、0．5、0．6、0．7、0．8mg／m1)作用6h、12h、24h后，对TE．13细胞增殖的抑制作用。3采用瑞．姬染色法观察不同浓度FSEER(0．4、O．5、0．6mg／m

3、1)作用于TE．13细胞24h后，对细胞形态的影响。4采用流式细胞(Flowcytometry,FCM)检测不同浓度FSEER(0．4、0．5、0．6mg／m1)作用于TE．13细胞24h，以及0．6mg／mlFSEER作用不同时间(6h、12h、24h)后，对细胞凋亡率以及线粒体膜电位的影响。5采用免疫印迹技术(Westernblot)检测细胞凋亡相关蛋白(PARP、caspase．3、caspase．8、caspase．9和胞浆Cyt．C)以及p．JAK、p-STAT3、p-ERKl／2在FSEER诱导TE．13细胞凋亡过

4、程中的作用。6通过RT-PCR方法检测O．4、0．5、0．6mg／ml的FSEER分别作用于TE．13细胞24h后，细胞凋亡相关基因Bax、Bad、Noxa、Bcl．2、Bcl．xl、Mcl．1表达的变化。7将16只8～lO周龄近交系BALB／c小鼠随机分为四组，建立小鼠免疫抑制模型，其中实验组和模型对照组均一次性腹腔注射Cy，200mg／kg。小鼠模型建立后第2天开始，实验组通过灌胃方式分别给予不同剂量(120、60mg／kg·day)的FSEER，模型对照组小鼠给予等量生理盐水(NS)，中文摘要均连续给药10天，正常对照组

5、不做任何处理，正常饲养。每天观察小鼠生存状态，于末次给药12h后称量体重，眼球取血处死小鼠，分离脾脏、骨髓、外周血，备用。8无菌分离各组小鼠脾脏，用滤纸吸干残血后称重，分别计算脾脏指数(SI)，公式如下：SI=脾脏重(mg)／体重(g)。9采用流式细胞术(FCM)检测各组小鼠外周血淋巴细胞CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞比例以及CD4+／CD8+比值的变化。lO采用ELISA方法检N4,鼠外周血淋巴细胞产生TNF．cL和IL．2的水平。11通过瑞氏．姬姆萨染色观察各组小鼠骨髓象的变化。结果：1六种连翘提取物FSW

6、ER、FSWEL、FSWEF、FSEER、FSEEL、FSEEF对TE．13细胞增殖有不同程度的抑制作用，其中FSEER效果最明显，与各组比较，差异具有统计学意义(尸

7、核固缩、核碎裂等典型的凋亡形态学改变，而对照组细胞大小均匀，生长密集。4FCM分析结果显示，不同浓度(O．4、o．5矛no．6mg／m1)FSEER作用24h后，TE．13细胞凋亡率逐渐升高，0．6mg／mlFSEER处理6、12、24h后，TE．13细胞凋亡率随时间延长而明显增高，组间比较差异有显著性(氏O．05)，各实验组与对照组比较差异有显著性(尸

8、组，差异具有统计学意义(尸<0．01)。6Westernblot分析结果显示，经FSEER处理后，TE．13细胞cleavedcaspase．3、cleavedPARP、cleavedcaspase．9和胞浆Cyt．C表达水平逐渐增加，与对照组相比差异有统计学意义(尸