过度训练大鼠肾组织热休克蛋白70的表达及山莨菪碱干预的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文过度训练大鼠肾组织热休克蛋白70的表达及山莨菪碱干预的研究姓名：杨洁申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：吴广礼201203中文摘要过度训练大鼠肾组织热休克蛋白70的表达及山莨著碱干预的研究摘要目的：近年来对过度训练引起的急性肾损伤(overtraining．inducedacutekidneyinjury,OTIAKI)fj4J研究越来越多，因为它已成为危害人类健康的重要疾病，但其发病机制和损伤方式尚不清楚，目前尚缺乏有效的防治方法。热休克蛋白(heatshockproteins，HSPs)又称应激蛋白，它是细胞应激反应的生物标志及内源性保护蛋白，其表达的强弱与组织

2、细胞的损害程度有关。其中热休克蛋白70(heatshockprotein70，HSP70)在生物细胞中含量最高，受到诱导最强，应激后生成最显著，具有多种生物学功能，对细胞有明确的内源性保护作用。本研究采取大鼠无负重单次游泳至力竭建立过度训练引起的急性肾损伤的模型，研究过度训练大鼠肾组织细胞HSP70的表达规律及其与肾组织细胞凋亡的关系，并观察山莨菪碱对HSP70表达的影响，探讨其作用机制。方法：(1)清洁级雄性SD大鼠48只，体重180--2209，按随机数字表随机分为三组：安静对照组(CN，n=8)、力竭运动组(ES，n=24)、山莨菪碱干预组(AD，n=16)。安静对照组(CN)未进行力竭

3、运动，不注射任何药物；力竭组又根据力竭后恢复时间不同分为力竭后即刻组(ESI)、力竭后6小时组(ES6h)幂g力竭后24小时组(ES24h)三个亚组，且各弧组大鼠在运动前20min给予灭菌注射用水lOm∥Kg一次性腹腔注射；山莨菪碱干预组也根据力竭后恢复时间不同分为山莨菪碱6h组(AD6h)矛D山莨菪碱24h组(AD24h)两个亚组，各亚组大鼠于运动前20min给予山莨菪碱注射液10mg／Kg一次性腹腔注射。每个时间点均为8只大鼠。采用大鼠无负重单次游泳至力竭建立过度训练引起急性肾损伤模型。(2)于各时间点，5％的水合氯醛(3ml／kg)腹腔注射麻醉，摘取两侧肾脏，将左侧肾脏放入EP管，迅速放

4、入液氮中，．80℃冰冻保存，待用于Westernblot技术检测肾组织HSP70的表达。右侧肾脏置于4℃4％多聚甲醛中固定，制作石蜡切片。(3)采用HE染色光镜下观察肾组织病理形态学变化。(4)采用免疫组化染色(PV法)观察肾组织HSP70的表达情况，并应用图像分析系统中丈摘要对免疫组化结果进行半定量分析。(5)应用Westernblot技术检测肾组织HSP70表达的变化。(6)统计分析：所有实验数据均采用SPSS13．0软件包进行统计学处理，实验数据均以均数4-标准差(牙±S)表示。组间比较采用单因素方差分析(one．wayANOVA)分析，以P<0．05认为有统计学意义。结果：(1)无负重

5、单次游泳至力竭后大鼠表现为极度疲劳的神态，精神萎靡，对外界刺激反应迟钝，胸腹着地，无法站立，活动困难，严重者可有球结膜出血的现象。力竭运动组大鼠约2h后方可自由活动，进食水情况欠佳，而山莨菪碱干预组大鼠约20min后可自由活动，基本可正常进食。(2)正常对照组大鼠肾组织结构无明显变化。力竭后即刻组、力竭后6h组肾组织结构改变轻微，有部分肾小球囊、肾小管扩张，近端肾小管上皮细胞水肿，出现空泡变性：力竭后24h组大鼠肾组织结构改变明显，在皮髓质交界处及髓质可见大量细胞的细胞核深染及固缩现象，间质可见浸润细胞，肾小管上皮细胞的刷状缘出现不规整甚至脱落的改变。山莨菪碱6h组及山莨菪碱24h组较同期单纯

6、力竭组比较大鼠肾组织结构改变明显减轻。(3)免疫组化染色检测肾组织HSP70的表达：阳性细胞多为肾小管上皮细胞，肾小球几乎无表达，且肾髓质中的细胞表达强于肾皮质。正常对照组大鼠’肾组织中有较弱的HSPT0的表达。力竭运动组大鼠随恢复时问的延长，肾组织HSP70蛋白的表达水平呈逐渐增高趋势，且同正常对照组相比均有统计学意义(P<0．05)。山莨菪碱干预组大鼠肾组织中HSP70的表达较同期力竭组比较阳性细胞数增加，且表达强度明显增强(P<0．05)。(4)Westernblot技术检测肾组织HSP70的表达：在内参GAPDH表达量基本一致的情况下，与正常对照组比较，随恢复时问的延长，力竭运动组肾组

7、织HSP70表达逐渐增强(P<0．05)。山莨菪碱6h组、山莨菪碱24h组较同期力竭组比较，‘肾组织HSP70表达增强(P<0．05)o结论：(1)HSP70在过度训练大鼠’肾组织中表达增强，且于力竭后即刻至力竭后24小时呈逐渐增高趋势，用免疫组化法观察肾髓质中的细胞表达强于肾皮质。(2)th莨菪碱干预组与同期力竭组比较，肾组织损伤减轻，肾组织HSP70的表达增强，山莨菪碱对OTIAKI的保护作用