莱菔硫烷对eae小鼠脾组织cd4+cd25+foxp3+调节型t细胞表达的影响及机制探讨

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1、河北医科大学硕士学位论文莱菔硫烷对EAE小鼠脾组织CD4+CD25+Foxp3+调节型T细胞表达的影响及机制探讨姓名：金学敏申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：郭力201203中文摘要莱菔硫烷对EAE小鼠脾组织CD4+CD25+Foxp3+调节型T细胞表达的影响及机制探讨摘要目的：探讨CD4+CD25+Foxp3+调节型T细胞和Nrf2／ARE通路在EAE发病及发展中的保护作用及机制，以及明确莱菔硫烷对EAE的保护作用。方法：1动物分组将18只体重在18-209的8．10周雌性C57BL／6小鼠，随机地分为EAE组和莱菔硫烷组，每组各9只。莱菔硫烷组(n_9)：MOG

2、35．55+结核菌素+百日咳毒素+CFA免疫小鼠，免疫后当天记为第0天，于免疫后第1天开始每隔一天腹腔注射莱菔硫烷50mg／kg。EAE组(n=9)：MOG35—55+结核菌素+百日咳毒素+CFA免疫小鼠，于免疫后第1天开始每隔一天腹腔注射生理盐水O．1ml／只做对照。2动物模型建立用生理盐水将免疫原MOG35．55人工合成多肽稀释成6mg／ml，然后在稀释液中按1：l的比例加入等体积的完全弗氏佐剂混合且加入结核杆菌H37Ra，并使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg／ml，然后把液体装入玻璃注射器，用一个短点滴管连接另一个玻璃注射器，不断来回推注使稀释液充分乳化，将乳化充分

3、的免疫原稀释液按每只0．1ml的剂量在小鼠脊柱两侧各分两点皮下注射，免疫当天记为0天，并在第oh及第48h，于小鼠左下腹腹腔注射0．5ml百日咳毒素(140愀)。3干预药物治疗莱菔硫烷组(SFN组)从免疫后第1天起每隔一天在同一个时间点于小鼠左下腹腹腔注射莱菔硫烷。莱菔硫烷按lmg里加入O．1ml生理盐水的比例稀释后，按一天50mg／kg的剂量给小鼠注射。而EAE对照组则与莱菔硫烷组同一个时间点注射O．1ml生理盐水做对照。4临床症状评分及体重变化小鼠免疫当天开始，采用双盲法每日早上8：00给小鼠称体重、评分。中文摘要每次两个人同时观察小鼠发病情况及体重变化情况并进行神经功

4、能评分。我们采用Weaver’s15分评分标准：每个肢体单独分开评分，最后将四肢评分和尾部评分加起来算总分，四肢全瘫加尾瘫计算为14分，死亡为15分。尾巴：0分：无临床症状1分：小鼠尾部无力或尾巴远端瘫痪2分：尾全瘫四肢：0分：无临床症状1分：小鼠步态不稳2分：小鼠肢体轻度瘫痪，行走时拖拽肢体3分：小鼠肢体全部瘫痪，行走时肢体向外翻“最高临床症状评分”为各组小鼠在观察期间内的最高临床症状评分。5发病率及发病时间的比较观察各组小鼠共有几只发病，计算每组发病率均数进行两组间比较；观察各组小鼠什么时候发病，计算其均数并进行两组间的发病时间的比较。6小鼠脾细胞分离与制备于免疫后第2

5、0天时，将EAE组和莱菔硫烷组小鼠全部统一断颈处死，剖腹取出脾脏，放在盛有生理盐水的培养皿里，剪碎，用玻璃注射器针芯研磨，经200目铜网过滤，放入离心管中，在4。C5417R型低温高速离心机里以1500r／min离心10分钟，弃上清，得到细胞沉淀，加入lml生理盐水混匀，取出100I_tl装入流式管中。7流式细胞术对流式管中的标本进行加入FITCdx鼠CD4抗体、APCdx鼠CD25抗体、PEd,鼠Foxp3抗体等免疫荧光抗体，避光孵育，固定破膜，洗涤，悬浮细胞等操作，最后将标本放在流式细胞仪上检测。用流式细胞仪自带软件进行计算，得出两组每只小鼠脾细胞表达的CD4+CD25

6、+Foxp3+调节型T细胞占CD4十T细胞的比例，并对两组CD4+CD25+Foxp3+调节型T细胞占CD4+T细胞的比例的均数间进行比较。中文摘要8统计学处理．实验数据采用SPSSl8．0软件进行统计分析，计量资料均以“均数±标准差(趸士S)”表示，两组计量资料均数的比较应用两独立样本均数t检验，P<0．05具有统计学意义，发病率以百分数表示，两组间比较采用卡方检验，P<0．05具有统计学意义。结果：1EAE模型对照组共免疫9只小鼠全部发病，发病率为100％；莱菔硫烷干预治疗组中4只发病，发病率为44．4％；莱菔硫烷干预治疗组的发病率显著低于EAE模型对照组，差异具有统计

7、学意义(尸