艰难梭菌临床分离株的分子流行病学及耐药性研究

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1、河北医科大学硕士学位论文艰难梭菌临床分离株的分子流行病学及耐药性研究姓名：杨靖申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：赵建宏201203中文摘要艰难梭菌临床分离株的分子流行病学及耐药性研究摘要目的：艰难梭菌(Clostridiumdifficile)是一种革兰阳性专性厌氧芽孢杆菌，通常在环境和人类肠道中正常存在。该菌由于产生毒素A、B而致病。过度应用抗生素、免疫抑制剂或化疗药物使耐药的艰难梭菌产毒株过度繁殖并释放毒素是导致艰难梭菌相关性腹泻(Clostridiumdi伍tileassociateddiarrhea，CDA

2、D)的主要因素。CDAD的发病率在全球范围内不断增加，尤其是高产毒株在北美地区造成了医院内的暴发流行，引起了世界范围的关注。所以，为了了解中国石家庄地区艰难梭菌的流行情况，我们对艰难梭菌临床分离株的毒素基因、PCR一核糖体分型、耐药性及耐药相关基因进行了一系列研究，为有效防止艰难梭菌的暴发流行提供依据。方法：2010年7月至2011年12月期间，共收集来自河北医科大学第二医院、河北医科大学第四医院、河北医科大学第一医院、河北省人民医院的粪便标本235份。首先，对这些标本用粪便基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，采用常规PCR的

3、方法直接检测粪便中艰难梭菌毒素A、B基因tcdA和tcdB；然后，对毒素阳性的标本通过富集芽孢培养法进行培养；最后，分离得到的艰难梭菌再通过多重PCR的方法同时检测艰难梭菌毒素A、B基因tcdA和tcdB、二元毒素基因cdtA和cdtB及16SrDNA基因。用常规PCR的方法对分离到的艰难梭菌进行PCR-核糖体分型，所得条带用QuantityOne软件进行比对分析。采用琼脂稀释法测定艰难梭菌对左氧氟沙星、万古霉素、甲硝唑、克林霉素、替加环素的最低抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcentration，MIC)，并

4、通过PCR的方法检测克林霉素耐药相关基因ermB。结果：235份粪便标本采用常规PCR的方法直接检测粪便中艰难梭菌毒素A、B基因，共检测出37份阳性标本，阳性率为15．7％。对37份PCR毒素阳性的标本用富集芽孢培养法进行艰难梭菌培养，共培养出32株菌，培养阳性率为86．5％。用多重PCR分别对分离出的32株菌进行毒中文摘要素A、B(tcdA、tcdB)、二元毒素A、B(cdtA、cdtB)及16SrDNA检测。发现所有菌株的毒素A、B基因均阳性，未检出二元毒素基因。32株艰难梭菌分成12种不同的PCR核糖体型。其中SI型最多，

5、占28％，没有发现核糖型027和078型。所有菌株对甲硝唑、万古霉素、替加环素均高度敏感。但是对克林霉素(MIC>128mg／1)和左氧氟沙星(MIC>64mg／1)出现了高水平耐药，并且耐药率较高，分别为100％$n87．5％。对美洛培南的耐药率较低为18．8％。32株对克林霉素耐药的艰难梭菌中，检出18株ermB基因阳性菌株，占56．25％。结论：1用常规PCR的方法检测艰难梭菌毒素A、B基因，可以对艰难梭菌感染行早期的诊断。2富集芽孢培养法，提高了艰难梭菌培养的阳性率，可作为一种有效的艰难梭菌培养方法在临床推广。3我国石家

6、庄地区流行的32株艰难梭菌产毒株以A+B+的菌株为主，未发现产二元毒素的菌株。4在该地区发现了12种不同的PCR核糖体型别，流行的菌株以SI型为主(28％)，没有发现核糖型027和078型。5本实验通过测定多种抗生素对艰难梭菌的MIC值，发现其对克林霉素、左氧氟沙星耐药率较高，部分菌株对美洛培南耐药，未发现对甲硝唑、万古霉素、替加环素耐药的菌株。在该地区甲硝唑和万古霉素，仍可以作为CDAD治疗的首选药物。关键词：艰难梭菌；毒素基因；二元毒素；PCR一核糖体分型；最小抑菌浓度；药物敏感性；耐药基因荚文摘要Studyonthemol

7、ecularepidemiologyandantibioticresistanceofClostridiumABSTRACTObjective：ClostridiumdifficileisaGram-positive，anaerobicspore-formingBacilluscommonlyfoundintheenvironmentandhumangut．TheenteropathogenicityofClostridiumdifficileisassociatedwiththeproductionofenterotoxinA

8、andcytotoxinB．Overuseingofantibiotics，immunosuppressiveagentsandchemotherapydrugsmayleadtoovergrowthofthetoxicstrainofCdifficilewit