局部浅低温对大鼠全脑缺血再灌注后pten表达的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文局部浅低温对大鼠全脑缺血再灌注后PTEN表达的影响姓名：乔丽艳申请学位级别：硕士专业：麻醉学指导教师：张山201203中文摘要局部浅低温对大鼠全脑缺血再灌注后PTEN表达的影响摘要目的：应用鼻咽腔降温法对大鼠实施头部降温，采用Pulsinelli四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注模型，观察局部浅低温对大鼠全脑缺血再灌注后PTEN表达的影响，并结合大鼠脑组织中MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)、S100B蛋白的含量以及海马CAl区凋亡相关蛋白Bcl一2、Bax的表达，探讨浅低温对大鼠全脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。方法：1实验分组及动物模型的制备1．1

2、实验分组选用健康成年雄性Wistar大鼠66只，体重230-2809(由河北医科大学实验动物中心提供)。随机分成3组：即假手术组(Sham组)，常温脑缺血再灌注组(I／R组)，浅低温脑缺血再灌注组(HI／R组)。其中，I／R组和HI／R组根据再灌注时间的不同(再灌注时间分别为4h、8h、12h、24h、72h)又各自分成5个亚组。共1l组大鼠，每组6只。1．2动物模型的制备及实验步骤用10％水合氯醛350mg／kg向大鼠腹腔注射麻醉成功后，将大鼠俯卧位固定于手术台上，于颈后正中切开皮肤，逐层分离肌肉暴露左右两侧翼突孔，用60瓦电烙铁分别烧灼两侧椎动脉使其永久闭塞，缝合切口。假手术组的

3、大鼠只暴露翼突孔但不闭塞椎动脉。24小时后再次麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定于手术台上，给大鼠气管插管，吸氧，保留自主呼吸。于大鼠双侧项部及颞部插入针状电极，用以动态监测脑电波。大鼠四肢插入电极检测心电图。尾静脉穿刺置管持续泵入乳酸林格氏液体，速度为lml／h。常温脑缺血再灌注组的大鼠操作至此步骤便可夹闭颈总动脉。浅低温组大鼠则在其鼻腔插入深度为Icm的细硅胶管并固定，然后将大鼠放在立体定位仪上固定好，切开头皮暴露骨膜，定好海马区体表标志后，用微型颅钻钻破颅骨，将温度探头置于其下2mm以测脑温。用静脉泵向大鼠鼻咽腔输注4"C冷生理盐水使其脑温降至33±0．5"C，并维持此温度1h。中文摘

4、要当大鼠脑温降至33。C后开始夹闭颈总动脉。假手术组大鼠只暴露颈总动脉但不夹闭。常温组和低温组大鼠夹闭两侧颈总动脉时在其颈前正中部作一纵行切口，然后逐层分离暴露颈总动脉，用手术丝线穿过颈总动脉并用动脉夹分别夹闭两侧颈总动脉，夹闭时间为15min。实验过程中根据大鼠麻醉深度间断给予水合氯醛维持麻醉。一2．标本采集及检测方法。2．1标本采集根据大鼠脑缺血后再灌注时间的不同，在规定的时间点将大鼠麻醉断头，打开颅腔并取出脑组织。大鼠的左半脑放入4％多聚甲醛液中固定。把大鼠的右半脑先装进标本袋后一并放入液氮罐1分钟，后快速放入一70℃冰箱中保存。大鼠的左半脑用于免疫组化检测P-PTEN、Bcl

5、一2、Bax，大鼠的右半脑用于制作组织匀浆检测iDA、SOD、S100B。2．2检测方法2．2．1MDA、SOD、S100B蛋白的检测将取出的右半脑组织与0．9％生理盐水制成10％和1％组织均浆。将配好的组织匀浆用离心机以4000转／分钟低温离心10分钟，取上清液。其中，1％的组织匀浆提取的上清液用来检测SOD活力，SOD活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法。10％组织匀浆提取的上清液用来检测MDA和S100B蛋白含量。MDA的测定采用硫代巴比妥酸法即TBA法。S100B蛋白检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。上述各指标的检测步骤严格按照相应试剂盒要求进行。Bcl-2、Bax、P

6、-PTEN的检测将固定好的左半脑组织取出，用手术刀片在中线旁开左半脑5mm处矢状切脑组织，外侧组织弃之。将修整好的组织常规进行脱水、透明、浸蜡、包埋，切片、脱蜡、入水、抗原修复、封闭等措施。Bcl一2、Bax、P-PTEN的检测均采用SP法，具体操作步骤严格按照相应试剂盒要求进行。结果：1．各组海马CAl区P．PTEN蛋白表达的比较与Sham组比较，I／R组在再灌注4h、8h、12h、24h、72h后P-PTEN均降低，组间比较差别有统计学意义(P

7、os)。在I／R组中，P-'PTEN在再灌注8h开始降低，再灌注12h明显降低，再灌注24h下降达最低值，再灌注72h有所升高但仍低于Sham组水平(尺0．05)o．2各组海马CAl区Bcl-2和Bax蛋白表达的比较与Sham组比较，I／R组的Bcl-2下降、Bax升高，组间比较差别有统计学意义，(P