二氮嗪对深低温脑缺血再灌注大鼠脑组织nr1表达的影响

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1、二氮嗪对深低温脑缺血再灌注大鼠脑组织NR1表达的影响：陈凤，莫绪明，顾群，彭卫，何晓敏，戚继荣【摘要】目的探讨二氮嗪对深低温缺血再灌注大鼠的脑保护作用及其机制。方法采用双侧颈总动脉阻断法制作深低温缺血再灌注大鼠模型，将306只SD大鼠随机分成3组:假手术组、二氮嗪组和模型组。分别在缺血1h后再灌注2、6、12h及1、2、3、7d断头取脑，对脑组织行含水量检测，并采用免疫组织化学技术检测脑组织NR1表达情况。结果假手术组脑组织含水量明显低于二氮嗪组和模型组，二氮嗪组低于模型组，模型组和二氮嗪组脑组织含水量在12h开始升高、1d达高峰、3d基本恢复正常，模型组和二氮嗪组NR1均在2h

2、开始升高、1d达到高峰、7d后基本达到正常水平，但二氮嗪组NR1表达水平在2、6、12h及1、2d明显低于模型组，且两组NR1表达水平均高于假手术组。结论二氮嗪预处理对深低温缺血再灌注大鼠具有脑保护作用，其作用机制可能是通过下调脑组织NR1的表达来实现。【关键词】深低温;脑缺血再灌注;二氮嗪;脑保护;NR1表达;大鼠　　脑缺血再灌注损伤及其机制十分复杂，至今尚不完全清楚。脑缺血再灌注损伤包括神经细胞坏死和凋亡两个方面，其中线粒体ATP敏感性钾通道被认为是关键环节之一［1］。二氮嗪是线粒体ATP依赖性钾离子通道开放剂，已广泛应用于缺血再灌注心肌保护方面的研究，而对脑保护方面的研究相

3、对较少。N-甲基天冬氨酸受体（NMDAR）是目前研究最为深入的兴奋性氨基酸（EAA）受体之一，是一种离子型EAA受体。目前已证实，NMDAR是由NR1、NR2A～2D5种亚单位组成的异聚体。其中NR1亚单位是NMDAR的功能单位，NR2是其调节单位，只有和NR1组合才表现出活性。NR1基因紊乱就会使NMDAR的活性丧失。EAA的毒性是通过受体活性改变而发挥作用，缺氧缺血能影响NMDAR的数量和功能，诱导和加强NR1的表达，上调NMDAR的数量。基于上述研究背景，本试验主要采用脑缺血再灌注大鼠模型，观察二氮嗪预处理对脑缺血再灌注损伤后脑含水量、形态学及NR1的表达变化来探讨二氮嗪对

4、深低温缺血再灌注大鼠是否具有脑保护作用及其可能的机制。　　1材料和方法　　1.1实验动物　　成年健康SD大鼠306只，雌雄不限，体重200～250g，由南京市儿童医院实验动物中心提供。动物饲养与实验均符合我国卫生部《医学实验动物管理实施细则（1998）》的要求。　　1.2主要仪器与试剂　　水合氯醛（南京市儿童医院提供）、二氮嗪（美国Sigma公司）、NR1（SantaCruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、荧光倒置显微镜（德国蔡

5、司）、801图像分析系统（江苏捷达）。　　1.3动物模型建立　　用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉后固定大鼠四肢及头部。剃除颈部及腹股沟处鼠毛，碘伏消毒皮肤，酒精脱碘后，纵行剪开颈部皮肤，从正中打开颈外肌层，分别向左右沿颈外斜肌间隙分离筋膜，找到颈总动脉，从伴行的神经旁游离出动脉并套上丝线，用纱布盖好切口;用涂有石蜡油的温度计插入肛门3cm，探测大鼠的体温（通过对大鼠深部体温检测来估计脑部的温度）。将鼠置冰盒并用冰块袋包埋大鼠行物理降温。当体温降至21℃时停止降温，用动脉夹阻断两侧颈总动脉，使体温维持在（21±1）℃，60min后恢复颈总动脉血流。用电吹风给大鼠复温，每分钟

6、体温恢复不超过0.5℃，大约在0.5h内将体温恢复到32℃，再将大鼠放入35℃早产儿孵育箱复温，在2h内将体温恢复到37.5℃体温，维持正常体温4h后放置室温下正常饲养。　　1.4动物分组　　①假手术组:102只，不夹闭左右颈总动脉，不注射药物;②模型组:102只，术前腹腔内注射等体积生理盐水;③二氮嗪组:102只，术前腹腔内注射二氮嗪5mg·kg-1。模型组和二氮嗪组再分为缺血60min再灌注后2、6、12h和1、2、3、7d共7个小组，假手术组分为术后2、6、12h和1、2、3、7d共7个小组，每个小组16只，其中6只用于脑组织含水量测定，10只用于石蜡包埋后行免疫组化检测。

7、　　1.5脑组织含水量测定　　待测含水量的脑组织标本测定其湿质量及在电热恒温干燥箱中100℃48h的干质量，以计算含水量。公式如下:含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。　　1.6脑组织中NMDAR1的表达情况　　大鼠脑组织予多聚甲醛灌注、固定，完毕后断头取脑，脑组织采用4%多聚甲醛溶液再固定约24h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。步骤如下:切片常规脱蜡，3%H2O2灭活内源性酶，热修复抗