含外源t细胞表位的猪细小病毒vp2基因真核表达质粒构建及免疫原性研究

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1、河北农业大学硕士学位论文含外源T细胞表位的猪细小病毒VP2基因真核表达质粒构建及免疫原性研究姓名：孙彦欣申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：范京惠20120526摘要猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPⅥ主要引起初产母猪的繁殖障碍。PPV除单纯感染猪以外，该病毒与猪圆环病毒(PorcinecircovimsType2，PCV-2)的混合感染更为普遍。这两种传染病在猪场并发或继发感染现象较为普遍，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪细小病毒是一种自主复制性DNA病毒，VP2衣壳蛋白是PPV的主要保护性抗原，而且具有很高的保守性。PCV-2基因组位于O

2、RFl内201．220位氨基酸的多肽P21，为一免疫优势T细胞表位，免疫动物后，动物体内的淋巴细胞明显增多，而且免疫动物血清中PCV-2特异的抗体水平亦明显升高，是研制抗原表位疫苗的优势目标表位。本研究选择猪细小病毒VP2基因以及猪圆环病毒2型多肽P21为目的基因，为了制备能够同时预防PPV和PCV-2两种病毒感染的DNA疫苗，本试验构建了共表达VP2基因和P21基因的重组质粒pcDNA．P21．VP2，并用构建的重组质粒进行了小鼠免疫试验，分析了重组质粒诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫反应。本研究对分离的PPV在PKl5细胞上进行增殖，根据Genbank报告的NAD

3、L-2参考毒株VP2基因的核苷酸序列，利用Primer5．0软件，设计合成一对引物，以PPV病毒的DNA为模板，应用PCR扩增VP2基因片段，将该基因片段克隆到pMD一18T载体，并进行了酶切、PCR鉴定和序列测定。将从pMD．18T-VP2中酶切纯化后的VP2基因克隆至真核表达载体pcDNA3．1(+)的BamHI和XhoI之间的多克隆位点上，并在VP2基因的5’端插入用酶促合成方法获得猪圆环病毒2型的T细胞表位基因P21，构建重组质粒peDNA-P21．VP2。经酶切鉴定，结果表明VP2基因与P21基因均正确插入到载体中。重组质粒pcDNA．P21．VP2，经磷酸

4、钙介导转染HEK293T细胞，使其在真核细胞中进行表达，经SDS-PAGE、Western-blot检测分析表达的重组蛋白。试验结果表明，表达的重组蛋白大小约为67kDa，与预测蛋白大小相符，并且表达的蛋白可被鼠源PPV抗血清与鼠源PCV-2抗血清所识别。采用肌肉注射pcDNA．P21．VP2阳性质粒接种Balb／c小鼠，用ELISA方法进行抗体检测试验，MTT法检测小鼠免疫后脾脏淋巴细胞的增殖活性。构建的pcDNA-P21．VP2质粒能够有效诱导小鼠产生明显的免疫反应，并且对淋巴细胞的增殖反应有明显促进作用。为研制抗PCV-2和PPV核酸疫苗提供了实验依据。关键词：

5、猪细小病毒；VP2基因；猪圆环病毒：P21基因；共表达质粒ConstructionandimmunogenicityofRecombinantplasmidofporcineparvovirusVP2genecarryinganexogenousTcellepitopeGraduateStudent：Sunyan-xinSupervisor：．Prof．FanJing-huiMajor：．PreventiveVeterinaryMedicineAbstractPorcineparvovirus(Porcineparvovirus，PPV)isthemaincauseo

6、freproductivefailureingnts．PPVInadditiontotheinfectedpigsalone，thevirusandporcinecircovirus(PorcinecircovirasType2，PCV-2)，mixedinfections8remuchmorecommon．Thetwokindsofinfecfiomdiseasesinthepigconcurrentorsecondaryinfectionismoreprevalent，．．causinghugeeconomiclossestothepigindustryVP2pr

7、oteinofPPVismajorprotectiveantigen，andishighlyconserved．PCV-2genomeislocatedwithinthe201-220aminoacidsoftheORFlpolypeptideP21，animmunodominantTcellepitopes，afterimmuneanimals，thelymphocytesoftheanimalsincreasedsignificantly,andPCV-2一specificantibodylevelsintheserumofimmunizedan