化疗药物筛选膀胱癌干细胞的初步研究

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1、化疗药物筛选膀胱癌干细胞的初步研究Preliminaryresearchonchemotherapyagentsortingbladdercancerstemcells院系：华山医院专业：外科学（泌尿外专业临床技能型)姓名：黎力平指导教师：王翔教授导师组成员：丁强教授方祖军教授瞿连喜副教授目录中文摘要1英文摘要2中英文缩略词表3ma4材料和方法1020iiit25^27参考文献28纖33在校期间发表论文情况39義40化疗药物筛选膀胱癌干细胞的初步研究中文摘要目的：膀胱泌尿上皮癌是泌尿系统的最常见的肿瘤而且预后不良。目前膀胱癌的治疗效果并不能令人满意。早在1977年就有学者提出了肿瘤干

2、细胞（CSCs)的假设。该假设认为肿瘤组织中的肿瘤干细胞是肿瘤发生、转移及复发的根源。最近十余年时间里，已经从实验室成功分离鉴定了急性髓性白血病的肿瘤干细胞。虽然7至9种人类CSCs己被成功分离鉴定，但其余大部分CSCs还未被分离鉴定，包括膀胱癌肿瘤干细胞。分离肿瘤干细胞的常用方法有3种。第一种也是最常见的方法是利用干细胞表面标志物，应用流式细胞技术进行细胞筛选；第二种是利用普通干细胞的培养基即无血清培养基的方法分选；最后一种则利用侧群细胞（SP)具有一定干细胞特性，应用流式细胞技术分离SP细胞作为肿瘤干细胞。但是以上3中方法因为各自原因都无法成功分离膀胱癌肿瘤干细胞。最近有报道使用

3、化疗药物在动物体内成功分选肝细胞癌肿瘤干细胞。因此，本研究基于该研究方法尝试利用化疗药物体外初步分选膀胱癌肿瘤干细胞，验证该方法的可行性。方法：使用丝裂霉素C按一定的浓度梯度持续24小时作用于膀胱泌尿上皮癌T24细胞系。使用WST-8细胞增殖与细胞毒性检测试剂检测药物对细胞的抑制率。获取剩余的耐药细胞进行下一部分实验。根据抑制率实验的结果设计丝裂霉素C的浓度为：0.03mg/ml，0.5mg/ml,2mg/ml,并分别作为实验组B、C及D组。使用对照组细胞作为A组。使用流式细胞仪检测实验组及对照组细胞的细胞周期。使用实时荧光定量PCR及免疫印迹法分别检测实验组及对照组细胞中OCT-4

4、及NAN0G的表达。结果：细胞抑制率实验显示抑制率有浓度依赖性，随丝裂霉素C浓度的上升呈递增的趋势。最大及最小抑制率分别为92.5%±1.0及64.1%±1.4{P<0.001)。在最高药物浓度的作用下只有7.5%的细胞存活。流式细胞仪细胞周期检测显示对照组及实验组D组中分别有24.00%及83.99%细胞位于G。G,期，15.33%及63.24%的细胞位于S期（/^<0.05)。相对于对照组，在实验组的细胞中两种重要的干细胞标志物OCT-4及NAN0G在蛋白及基因水平明显增高，并与丝裂霉素C的作用浓度呈浓度梯度。结论：使用丝裂霉素C作用24小时后，剩余的膀胱泌尿上皮癌细胞呈现出干细

5、胞的特性。结合无血清培养技术，化疗药物筛选有望成为分离膀胱泌尿上皮癌干细胞的新方法。关键词：膀胱泌尿上皮癌，肿瘤干细胞，OCT-4，NAN0GPreliminaryresearchonchemotherapyagentsortingbladdercancerstemcellsAbstractBackgroundBladdertransitionalcellcancers(BTCC)isthemostcommonurologictumorinChinaandithasunfavorableprognosis.Thecurrenttherapyeffectisnotsosatisfato

6、ry.In1977，thecancerstemcell(CSC)hypothesiswasinitiallyproposed.CSCshypothesisindicatethatthereasonfortumorigenesis，metastasisandrecurrenceoftumorsistheexistenceofCSCsintumors.CSCsisthetargetsfortumortargetingtherapy.Cancerstemcells(CSCs)wereverifiedexperimentallyinacutemyeloidleukemiainthelastd

7、ecades.ThoughtheexistenceofCSCsweresubsequentlyverifiedinvarioustumors,CSCsofbladdertransitionalcellcancers(BTCC)hadnotbeenidentifiedbythecommonmethodsreported.AccordingtothephenomenonthatCSCswereresistanttochemotherapy,weusedmito