肺炎链球菌dnaj对细菌毒力的影响及其在诱导宿主天然免疫反应中的作用

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1、重庆医科大学硕士学位论文肺炎链球菌DnaJ对细菌毒力的影响及其在诱导宿主天然免疫反应中的作用姓名：崔瑾申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：尹一兵201204重庆医科大学硕士研究生学位论文肺炎链球菌DnaJ对细菌毒力的影响及其在细菌诱导宿主天然免疫反应中的作用摘要肺炎链球菌(&懈，fD∞cc螂p力P溯zD刀f口P，Sp刀)是一种常见的革兰阳性条件致病菌，其引起的肺炎、脑膜炎和败血症等疾病在全球有很高的发病率和死亡率。近20年研究发现＆p船的许多蛋白，可作为炎症介质或直接损伤宿主组织，且编码这些蛋白的基因突变后，细菌的毒力显著下降，因此＆p玎的毒力蛋白在肺炎链球菌感染

2、的发病机制中起重要作用。细菌由外界环境进入宿主后必然面临生存条件的改变，它们会应激性地调整基因表达以适应环境的选择压力，细菌的热休克蛋白(HeatShockProtein，HSP)正是应激诱导产生的一组对细菌本身具有保护作用的相关蛋白。从理论上讲，这些应激表达的HSP往往是细菌潜在的毒力因子。因此全面理解肺炎链球菌HSP对自身毒力的影响及其与宿主免疫细胞间的相互作用将有助于抗肺炎球菌感染的新型治疗试剂的开发。DnaJ／Hsp40蛋白就是一种高度保守并广泛存在的热休克蛋白，作为DmK的共分子伴侣，激活DnaK的ATPase活性。Sp刀的DnaJ蛋白是一种表面蛋白，已有研究显示该

3、蛋白具有疫苗的潜力，腹腔或粘膜接种使宿主产生抵抗多种血清型跏刀感染的获得性免疫反应。但是，3重庆医科大学硕士研究生学位论文DI讲蛋白是否参与细菌致病以及DnaJ蛋白与宿主天然免疫细胞的相互作用尚不清楚。本研究分别从体内、体外两方面观察肺炎链球菌幽∥缺陷对自身毒力的影响及DnaJ在诱导宿主天然免疫反应中的作用——促炎因子的分泌，模式识别受体(PRR)对DI埘蛋白的识别，信号通路的激活。研究内容包括以下三个部分：l、构建．跏刀的幽彬基因缺失的突变体，观察温度应激时其体外生长情况，为后续研究DnaJ在细菌和与宿主相互作用中所扮演的角色提供实验菌株和技术平台。采用长臂同源多聚酶链式反

4、应(LFH．PCR)方法，制备中间为红霉素耐药基因(P朋)，两侧为幽衫基因上、下游同源序列的连接片段，转化肺炎链球菌D39或R6菌，在含红霉素的血平板上筛选并采用PCR及测序鉴定缺陷菌株。结果显示缺陷菌株的砌衫基因完全被P嬲基因替代；革兰染色后形态无变化，但其菌落明显变小；30℃和37℃时体外生长曲线与野生菌大体一致，但20℃和40℃时生长明显受抑制，几乎不能生长。2、分别从体内、体外两方面观察肺炎链球菌砌∥缺陷对自身毒力的影响。腹腔攻毒后直接观察感染野生菌或缺陷菌小鼠的生存情况；滴鼻感染．跏门建立小鼠肺炎模型，计数易感组织的细菌载量，明确砌衫缺陷对细菌自身定植能力的影响；将

5、。印力感染小鼠肺上皮细胞MLEl2，4重庆医科大学硕士研究生学位论文比较野生和缺陷菌株黏附及侵袭能力的差异。毒力实验显示如∥缺陷菌组的小鼠可耐受致死剂量的＆p刀并长期存活；定植实验发现缺陷菌组小鼠鼻咽部和肺部的细菌载量均显著低于野生菌组，并迅速清除入血的缺陷菌；幽彬缺陷使Sp刀对MLEl2细胞的黏附侵袭能力显著减弱，而且用抗DnaJ抗血清预处理MLEl2后野生菌对该细胞的黏附能力明显下降。3、明确S即砌衫基因缺陷后宿主或免疫细胞对该菌天然免疫反应的变化，再从分子水平筛选宿主识别DnaJ诱导先天性免疫的模式识别受体和下游信号通路。建立小鼠Sp刀的肺炎模型，取感染肺组织切片染色观

6、察炎症反应，定量PCR和ELISA检测促炎因子的表达；小鼠巨噬细胞RAW264．7感染＆p力，比较该细胞对野生菌和缺陷菌的吞噬能力及炎症因子分泌水平；原核表达并纯化DnaJ全长蛋白刺激RAW264．7，检测促炎因子的水平，定量PCR筛选识别Dn“蛋白的TLRs，并用抗TLRs单抗验证，蛋白激酶抑制剂筛选DI脚蛋白诱导促炎因子的相关信号通路，Westemblot进行验证。体内实验显示＆川的砌彬缺陷后其感染小鼠的肺部炎症反应强度下降、促炎因子分泌峰值降低且达峰时间延迟；体外实验发现幽∥缺陷后RAw264．7对＆p刀的吞噬增加，促炎因子分泌下降。DnaJ蛋白单独作用于RAW264．

7、7后可活化P13K、ⅢK信号通路，刺激促炎因子IL．6的分泌，此过程不依赖TLR2和TLR4。关键词：肺炎链球菌；DnaJ；毒力；天然免疫重庆医科大学硕士研究生学位论文THEROLEoFPNEUMoCoCCALDNAJINBACTERIALVIRULENCEANDINNATEIMⅣrUNITYINDUCEDBYSTREPTOCOCCUSPNEUMoNIAEABSTRACTThegr锄-positiVehumanopportuIlisticpathogell，5路，叩ZDcoccz厶，p刀P甜朋D，z砌P