白芍总苷改善老年性痴呆的机制研究

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1、河北医科大学硕士学位论文白芍总苷改善老年性痴呆的机制研究姓名：李岩申请学位级别：硕士专业：中药学指导教师：王鑫国201203中文摘要白芍总苷改善老年性痴呆的机制研究摘要目的：白芍总苷(Totalglucosidesofpaeony，TGP)为白芍根中提取的有效部位，主要含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、芍药花苷、苯甲酰芍药苷等单萜类化合物。现代药理研究表明，白芍总苷具有抗炎，免疫调节，保肝，抗氧化，并对中枢神经系统有一定的保护作用。有学者研究发现芍药苷对东莨菪碱致小鼠记忆形成障碍、亚硝酸钠致记忆巩固障碍和乙醇致记忆再现障碍有明显的改善作用。本课题组前期研究亦发现TG

2、P对拟血管性痴呆大鼠的行为学有一定的改善作用。为探索TGP改善老年性痴呆的作用机制，扩大TGP的临床应用及研制治疗老年性痴呆新药，本研究采用体外培养人神经母细胞瘤细胞SK-N．SH细胞，以连二亚硫酸钠复制SK．N．SH细胞缺氧损伤模型，从细胞及分子水平，初步探讨TGP防治老年性痴呆的作用机制。方法：采用连二亚硫酸钠建立SK．N．SH细胞缺氧损伤模型，实验分为正常对照组(control组)、模型组(Na2S204缺氧无保护组)及TGP50，100，200，400，800mg／L。Na2S204于不同浓度TGP干预1h后加入，作用16h，观察不同浓度的TGP对SK。N．S

3、H细胞缺氧损伤的保护作用。l形态学观察倒置相差显微镜下观察各组SK-N．SH细胞生长及形态的变化。2MTT法检测细胞存活率MTT法测定各孔的存活率，以OD值表示。3乳酸脱氢酶(LDH)活性及LDH释放抑制率上述损伤发生后16h，收集细胞培养上清液，按试剂盒说明书测定LDH的活性。LDH释放抑制率=(模型组LDH．给药组LDH)／(模型组LDH．对照组LDH)×100％4超氧化物歧化酶(soo)活性检测采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，分别取细胞培养上清液，按试中文摘要剂盒说明书顺序加入相应试剂，比色法检测细胞培养液中SOD的吸光值并计算其活性，其单位以U／mL表示。5

4、丙二醛(MDA)含量检测采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，分别取细胞培养上清液，按试剂盒说明书顺序加入相应试剂，比色法检测细胞培养液中MDA的吸光值并计算其含量，其单位以nmol／mL表示。6TUNEL法检测SK．N．SH细胞细胞凋亡取对数生长期细胞接种于放有盖玻片的6孔板中，做细胞爬片。缺氧保护16h后，PBS洗3次，80％乙醇固定，晾干，保存，TUNEL法检测SK-N．SH细胞细胞凋亡。。．7Westernblot法检测SK．N．SH细胞Caspase．3蛋白表达水平缺氧保护16h后，收集细胞，RIPA裂解液裂解细胞，Western．blot法测定Caspase．

5、3蛋白表达。结果：’l细胞形态学观察正常对照组SK．N．SH细胞呈圆形，较少有突起，为贴壁细胞，折光性较强；模型组多数细胞肿胀，折光度减弱j最终细胞成团、漂浮，并有许多细胞崩解物，TGP各浓度组均较模型组细胞数量较多，折光性明显增强，细胞裂解碎片减少，多数细胞重新贴壁伸展。2TGP最佳作用浓度与最佳作用时间的确定与正常对照组相比，模型组OD值显著降低(P0．05)，TGP200、1000mg／LOD值明显高于模型组(P

6、间，最终确定TGP预孵育浓度为如下梯度：50、100、200、400、800mg／L，Na2S204(终浓度为5mmol／L)于不同浓度TGP干预1h后加入，最佳预孵育时间为16h。3MTT法检测细胞存活率与正常对照组相比，模型组OD值显著降低(PO．05)，TGP100、200、400、800mg／LOD值均显著高于模型组(P

7、与模型组相比，TGP50、100、200、400、800mg／LLDH漏出量显著降低(P0．05)，TGP100、200、400mg／LSOD活性均有显著提高(P