电刺激调控胶质细胞活性促进光损伤感光细胞存活的实验研究

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1、复旦大学博士学位论文电刺激调控胶质细胞活性促进光损伤感光细胞存活的实验研究姓名：周文婷申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：徐格致2012-04-10复旦大学博士论文中文摘要电刺激调控胶质细胞活性促进光损伤感光细胞存活的实验研究中文摘要第—部分：电刺激促进光损伤感光细胞存活的神经保护作用体外培养感光细胞系(661Vl『)，接种于六孔板贴壁后，放入光照培养箱中接受416h光照强度为15，000lux的宽谱蓝光照射。在光照后的24h进行LDH细胞坏死测定实验、TUNEL凋亡染色及免疫荧光染色观察661W的凋亡情况以及形态学改变。结果显示：光照后，LDH实验显示59．7％±2．7％的661

2、W细胞坏死，TUNEL显示70％左右的染色阳性即凋亡，而免疫荧光染色则发现正常661W呈扁平状，细胞之间连接紧密，但光损伤后661W突触变细长，细胞失去扁平形态，且细胞间隙明显变大，表明光损伤诱导感光细胞凋亡模型成功建立。利用lh双相方波、直流电刺激(3IllS，20Hz，300’1600laA)预先作用于光损伤661W和小胶质细胞或Muller细胞共培养体系，并将其视为干预组；将未接受电刺激的此共培养体系视为未干预对照组；正常661W细胞和小胶质细胞或Milller细胞共培养体系视为正常对照组。在共培养后3h、6h、12h、24h进行LDH实验，并在共培养后24h进行TUNEL凋亡染

3、色实验及免疫荧光染色。结果如下：LDH凋亡一时间曲线表明1000雌的电刺激预先作用于光损伤661W和小胶质细胞共培养组之后，相较于未干预组相对应时间点的细胞死亡率，从共培养后12h开始661W的细胞死亡率显著降低，并保持相对恒定直到共培养后24h；同样，1600“A的电刺激预先作用于光损伤661W和Muller细胞共培养组之后，从共培养后3h开始661W的细胞死亡率显著降低，并逐渐加大降低幅度直到共培养后24h。TUNEL染色则显示共培养后24h，电刺激干预组的TUNEL染色阳性细胞比率较未干预组明显减少。免疫荧光染色也提示了光损伤661W细胞和小胶质细胞干预组的661W较未干预组细胞

4、形态改变程度轻，细胞间隙更小。另一方面，我们也将电刺激总用于光损伤后单独培养的661W细胞，并在相同时间节点进行LDH、TUNEL及免疫荧光染色实验，但结果与作用于共培养体系的电刺激不同，电刺激干预并未减轻661W细胞的凋亡。本部分的实验研究结果表明，电刺激能够减轻强光照射引起的感光细胞凋亡变性，但感光细胞本身对电刺激并没有反应，可能电刺激改变了胶质细胞的活性，而胶质细胞活性的改变转而影响了感光细胞的存活。第二部分：光损伤诱导感光细胞变性激活视网膜胶质细胞，激活的胶质细胞进而影响光损伤感光细胞凋亡的作用成功建立了光损伤诱导感光细胞变性的模型后，我们进一步利用胶质细胞与复旦大学博士论文中

5、文摘要光损伤感光细胞共培养体系(未干预组)探索小胶质细胞和MUller细胞受光损伤感光细胞影响后的数量、形态学的改变以及相伴随的功能的变化，同时探索平行的661W细胞的生存状态变化。正常661W细胞和小胶质细胞或Milller细胞共培养组视为正常对照组。在共培养24h后利用免疫荧光染色观察两组小胶质细胞或MUller细胞数量及形态学的差异；同时利用Real-timePCR和Westernblot法在共培养后3h，6h，12h，24h对两组小胶质细胞所分泌的促炎因子IL一113、TNF—Q以及Milller细胞所分泌的神经营养因子BDNF、CNTF的基因表达量和蛋白分泌量两组差异以及时间

6、趋势变化进行定量分析。并且运用LDH、TUNEL及免疫荧光染色等实验检测单独培养光损伤661W细胞和与小胶质细胞或MUller细胞共培养的661W细胞坏死和凋亡率的差异。结果显示：免疫细胞化学实验发现与正常661W细胞共培养的小胶质细胞成静息状态，形态成分支状，突触长，胞体较小，而与光损伤661W细胞共培养的小胶质细胞成激活状态，形态成阿米巴样或圆形，突触短，胞体大，且数量较正常对照组增多。两组MUller细胞的形态则无显著差异。另外，在共培养后的24h，RealtimePCR和Westernblot显示与光损伤661W共培养的小胶质细胞IL-1D和TNF—Q的基因和蛋白表达量较正常对

7、照组显著上升，与光损伤661W共培养的MUller细胞BDNF和CNTF的基因和蛋白表达量也较正常对照组明显上调；蛋白量一时间趋势曲线则发现在正常对照组中，小胶质细胞分泌的IL一1B和TNF—a在共培养后3h至24h时间段内基本保持稳定且较低的水平。而相反的，与光损伤661W共培养的小胶质细胞分泌的IL—l13蛋白量则随着时间进展逐步升高，在共培养后24h达到最高峰；同样，其所分泌的TNF-Q蛋白量也随着时间上调，在共培养后12h达到最高峰，之