小胶质细胞抗原呈递功能的调控在大鼠视网膜光损伤模型中的作用研究

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1、复旦大学博士学位论文小胶质细胞抗原呈递功能的调控在大鼠视网膜光损伤模型中的作用研究姓名：孙中萃申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：徐格致2012-04-05复旦大兰堡主笙茎——』兰墅堡．小胶质细胞抗原呈递功能的调控在大鼠视网膜光损伤模型中的作用研究中文摘要第一部分：SD大鼠光损模型的建立及观察本部分研究选用成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重180-210克(g)。所有实验大鼠均在12小时(h)明(30～50Lux)及12h暗(0～10Lux)循环光环境下适应7天(d)后，予以缝线开睑，1％阿托品扩瞳。经24h暗适应(0～10Lux)，放入光照箱中接受24h强度为

2、2500Lux的宽谱蓝光(波长400～440nm)照射，温度控制在22～25摄氏度(℃)。光照结束后再次置于黑暗(0～10Lux)环境下适应24h，后恢复12h明以及12暗循环光环境。在光照后即刻(Oh)、2h、6h、1天(d)、3d、7d、及14d时取大鼠视网膜切片，行苏木素．尹红(H．E)染色及TUNEL染色观察实验大鼠视网膜组织结构的改变及细胞凋亡的情况。结果显示：正常SD大鼠视网膜切片见各层层次清晰，由内向外依次可见3层界限分明的核层，由苏木素着染呈蓝紫色。最内层为神经节细胞核层(GCL)，由一至二层细胞核，较大，可见核仁，其内为视网膜神经纤维层(NFL)；中间层为内核层(IN

3、L)，多层细胞核，比GCL层小，排列较外核层(ONL)略稀疏；最外层为ONL，细胞层次最多且最密集，核小且深染。感光细胞内／外节(IS／OS层)层位于ONL之外，尹红着染呈红色，排列整齐，内／外节间见少量间隙。光照主要损伤外层视网膜，尤其是ONL和IS／OS层。光镜下观察，视网膜损伤性改变最早出现于光损伤后6h，见IS／OS肿胀，排列紊乱，此时ONL无明显改变；光损伤后ld，IS／OS层破坏，见ONL细胞核排列紊乱而厚度尚未变化；光损伤复旦大学博士论文中文摘要后3d，IS／OS层几乎消失，ONL细胞核显著减少，核质固缩，厚度明显变薄，提示光感受器大量丢失；光损伤后7天，ONL进一步变薄

4、，细胞核丢失；光损伤后14d时ONL仅剩余一至二层细胞核，视网膜显著变薄。光照主要通过细胞凋亡的途径损伤ONL。正常大鼠视网膜切片呈TUNEL(一)；光损伤后2h，于ONL出现TUNEL(+)细胞，INL和GCL呈TUNEL(一)；光损伤后ld，ONL中TUNEL(+)细胞数量达到最高峰，阳性细胞核皱缩，染色质凝聚成致密的块状，多聚集于核膜下，呈现“新月形”及“环形”等染色质边集的典型细胞凋亡特征；光损伤后3d，0NL的TUNEL(+)细胞数量开始减少，伴随ONL细胞数量显著减少；光损伤后14d，ONL细胞几近消失，仅存一至二层，TUNEL(-)。由此可见，光照主要通过凋亡的方式损伤大

5、鼠ONL，ONL细胞凋亡先于细胞数量的减少。第二部分：SD大鼠光损模型中小胶质细胞的活化、迁移及抗原呈递功能的变化光损伤后2h、6h、ld、3d、7d、14d，采用免疫荧光染色观察SD大鼠视网膜OX42(+)细胞(小胶质细胞)的形态和迁移；观察小胶质细胞主要组织相容性分子II(MHC．II)及其上游分子CIITA的表达。结果显示：正常SD大鼠视网膜切片中可见少量OX42(+)细胞，主要位于NFL和内丛状层(IPL)内，细胞多突起，呈细分枝状，0NL或视网膜下均呈OX42(．)；光损伤后即刻，OX42(+)细胞开始出现在ONL，细胞形态多样，仍有突起，但较正常时突起减少，且更粗大；随后视

6、网膜外层0X42(+)细胞迅速增加，随时间逐渐向外层移动；光损伤后3d，OX42(+)细胞数量达到最高峰，主要位于IS／OS层和视网膜下，细胞边界圆润光滑，呈阿米巴样外观，细胞突起显著减少。正常SD大鼠视网膜切片中MHC—II(+)细胞很少，偶见位9复旦大学博士论文中文摘要于NFL的单个MHC—II(+)细胞；直至光损伤后3d，可于IS／OS层和视网膜下见部分MHC-II(+)细胞；此后逐渐减少，至光损伤后7d，MHC．II(+)细胞基本消失。作为MHC-II的上游分子，CIITA具有相似的表达情况。第三部分：感光细胞间维生素A类结合蛋白(mBP)R16多肽免疫治疗对光损伤模型中光感受

7、器的保护作用本部分研究实验大鼠分为IRBPR16治疗组、PBS对照组和空白对照组。IRBPR16治疗组注射IRBPR16多肽进行免疫干预后建立光损伤模型，PBS对照组注射PBS后建立模型，而空白对照组不做任何处理，直接进行光照。结果显示：PBS对照组表现为光损伤后6h见视网膜IS／OS肿胀，但ONL细胞层次无明显改变；光损伤后ld，IS／OS破坏，ONL细胞核排列紊乱，但此时ONL厚度未见明显改变；光损伤后3d，IS／OS几乎消失，ONL层次显