丁苯酞对als模型小鼠生存期及cdk5p35表达的影响

《丁苯酞对als模型小鼠生存期及cdk5p35表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河北医科大学硕士学位论文丁苯酞对ALS模型小鼠生存期及CDK5P35表达的影响姓名：张红丽申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：李春岩；刘亚玲201203中文摘要丁苯酞对ALS模型小鼠生存期及CDK5P35表达的影响摘要目的：肌萎缩侧索硬化(amotrophiclateralsclerosis，ALS)是神经系统的变性疾病，选择性损伤上、下运动神经元，表现为进行性加重的肌肉无力、萎缩，其中90％以上病例为散发，10％左右为家族性【l】。其发病机制尚不清楚，可能涉及包括氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸

2、毒性作用、神经炎性反应、细胞凋亡、钙超载、异常蛋白聚集等方面，目前尚缺乏有效的治疗方法。CDK5是脯氨酸限定性丝／苏氨酸(Ser／Thr)蛋白激酶，它由292个氨基酸残基组成，相对分子质量为33×103的蛋白质，为一种特殊的细胞周期依赖性激酶家族成员，它既不受细胞周期素调节也不调节细胞周期，而是受非细胞周期蛋白P35和P39的调节。研究发现CDK5激酶活性异常升高会导致一些神经变性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化等的发生，其作用机制为兴奋性氨基酸毒性、钙超载、自由基形成等毒性因素导致CDK5活性升

3、高，激活钙依赖性蛋白酶，从而促使P35裂解为P25，P25／CDK5复合物形成并持续激活其活性进一步磷酸化神经丝蛋白等底物。轴索运输和细胞骨架是ALS发病的中心环节，而NFs异常蓄积是导致轴索运输障碍的直接原因，CDK5对Tau蛋白和神经丝蛋白的过度磷酸化进一步导致细胞骨架和轴索运输异常，从而参与ALS疾病的病理发生过程。因此抑制CDK5的胞浆内移，减少P35转化为P25，可能会减缓疾病的发生发展。丁苯酞(d1．3n．butyphthalide，NBP)是从芹菜种籽中分离出的有效成分，能显著治疗缺血性脑血管病

4、，大量研究证实丁苯酞具有保护线粒体功能，抑制细胞内钙超载，减少神经元凋亡和炎症反应等神经保护作用。近来有研究认为丁苯酞对神经系统变性疾病也有一定疗效。本实验应用丁苯酞对家族性肌萎缩侧索硬化模型hSODlG93A转基因鼠进行干预，观察丁苯酞对hSODlG93A转基因鼠旋转实验及生存期的影响；通过甲苯胺蓝染色观察终末期各组小鼠脊髓前角运动神经元数目及通过免疫组化、免疫印迹观察脊髓前角CDK5、P35的表达，旨在研究丁苯中文摘要酞对SODlG93A转基因鼠的疗效。方法：1动物分组及给药方法筛选鉴定出hSODlG93

5、A阳性的小鼠48只，并随机分为低、中、高剂量丁苯酞组和安慰剂组，选同窝hSODlG93A阴性小鼠作为阴性对照组，每组各12只，雌雄各半。于小鼠6周龄起分别按照60mg／kg、120mg／kg、180mg／kg剂量的丁苯酞对三个治疗组小鼠进行灌胃，安慰剂组给予同等量(10ml／kg)的玉米油灌胃，一天一次。2行为学观察2．1旋转实验于10周时开始评价hSODlG93A小鼠的运动功能，将小鼠放在直径为30mm的滚轴上，开始旋转，转轮在180s内转速由lrpm逐渐增加至30rpm，每只小鼠测定3次，取小鼠待在转轮上

6、时间最长的一次记录，每周一次，测试之前均接受5天的适应性训练。2．2生存期的判定将小鼠侧卧位放置在平板上，如其不能在20秒内翻身为正常姿势者，判定为死亡，该天记录为小鼠死亡时间，生存期为小鼠从出生到死亡的天数。‘3病理学用10％水合氯醛将小鼠麻醉后，心脏灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规组织切片。5岬厚的石蜡切片应用1％甲苯胺蓝染色，-观察脊髓前角神经元存活情况。4免疫组化用10％水合氯醛将小鼠麻醉后，心脏灌注4％多聚甲醛固定20m

7、in，快速取出小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，振动切片309m厚，免疫组织化学法观察髓前角神经元CDK5表达分布。5免疫印迹lO％水合氯醛腹腔注射将小鼠麻醉后，新鲜取小鼠脊髓腰段，液氮速冻，．80。C储藏，提取总蛋白用蛋白免疫印迹的方法检测各组hSODlG93A鼠腰髓CDK5、P35蛋白表达。中文摘要6统计学方法计量资料用X+SEM表示，所有实验数据均采用SPSS13．0软件进行统计学处理，Kaplane．Meier(K．M)生存曲线用于生存时间的统计分析，转轮实验的比较采用重复测量设计的多因素方差分析

8、，生化指标和病理学结果应用ANOVA方差分析或秩和检验。P<0．05为有统计学意义。结果：1生存期三个丁苯酞治疗组与安慰剂组相比生存期分别延长6天、2天、12天，但高剂量丁苯酞组能明显延长小鼠生存期9．2％，P=0．008，具有统计学差异。2行为学通过旋转实验观察发现高剂量丁苯酞组在13周到16周时能显著延长hSODlG93A转基因小鼠的旋转时间，与安慰剂组比具有统计学差异。低中剂量丁苯酞治疗组可轻