wnt5a信号通路在胰腺癌侵袭转移中的作用

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1、第二军医大学博士学位论文Wnt5a信号通路在胰腺癌侵袭转移中的作用姓名：卜海激申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：朱明华20120518wnt5a信号通路在胰腺癌侵袭转移中的作用摘要胰腺癌是发生在胰腺外分泌腺体的消化系统恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的1．4％，其中90％以上为胰腺导管腺癌。胰腺癌1年生存率为8％，5年生存率小于5％，中位生存时间仅4．6个月，死亡率居恶性肿瘤第8位。由于其临床表现隐匿，缺乏敏感性高、特异性强的早期诊断手段，大多数患者就诊时已属中晚期，因而病程凶险，死亡率高，其中侵袭转移是胰腺癌主

2、要致死原因。因此研究胰腺癌的生长侵袭转移特点有重要的临床应用价值。wnt5a是近年来备受关注的Wnt家族成员。Wnts通过wnt信号传导系统调控多种细胞功能如增殖、凋亡、分化、迁移及细胞极性等，在生长发育过程中，各成员呈现独特的表达方式和不同的功能。Wnt5a因其广泛参与多种作用途径并在机体发育及疾病发生发展过程中发挥重要作用而备受瞩目。Wnt5a参与众多的生理性和病理性的进程，在多种上皮和间叶性肿瘤中可见Wnt5a蛋白的异常表达。但与经典型wnts在肿瘤中多表现为表达上调不同，Wnt5a在肿瘤组织中表达并不一致；对Wnt

3、5a蛋白功能的研究在不同肿瘤中也常常得到互相矛盾的结果。Wnt5a对肿瘤的发生发展是致癌还是抑癌因素，众多的实验得出了截然不同的结论。Wnt5a在结直肠癌、神经母细胞瘤及白血病等肿瘤中起抑癌作用，并表达下调。Wnt5a下调与更高的肿瘤分级正相关，且在不同肿瘤亚型中是一个独立的预后不良的因素。而在皮肤黑色素瘤、乳腺癌细胞、胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等肿瘤中Wnt5a蛋白过表达且影响肿瘤的迁移和侵袭能力，呈现癌基因的特性。因此Wnt5a在不同的肿瘤中有截然不同的表达方式和功能定位。目前在胰腺癌中，对Wnt5a蛋白表达

4、的研究报道并不一致，其功能和作用机制仍未清楚。为了研究Wnt5a蛋白在胰腺导管腺癌中的表达形式，明确Wnt5a在胰腺导管腺癌中的功能定位，初步探讨其作用机制，我们设计了本课题。目的：观察Wnt5a蛋白在胰腺癌组织中的表达状况，并通过细胞转染技术建立稳定Wnt5a蛋白过表达和低表达的胰腺癌细胞株，检测不同Wnt5a蛋白表达状况对胰腺癌细胞增殖迁移侵袭等生物学行为的影响，初步探讨wnt5a蛋白影响侵袭转移的途径。方法：①通过组织芯片wnt5a蛋白免疫组化染色，分析wnt5a蛋白在胰腺癌肿瘤组织与癌旁组织中表达的差异；并结合临床

5、病理参数分析Wnt5a与临床病理参数之间的关系；对病例资料进行随访观察，根据不同Wnt5a蛋白表达状况作生存分析。第二军医大学博士学位论文(D构建wnt5a过表达和干扰质粒，通过脂质体法和电穿孔法将过表达和干扰质粒导入胰腺癌细胞株PANC．1和BXPC．3中，筛选稳转抗性克隆，Westem-Blot验证稳转细胞株的wnt5a蛋白表达状况。(D观察不同wnt5a蛋白表达水平的胰腺癌细胞株的生物学行为：通过MTT法检测胰腺癌细胞株的生长增殖能力；克隆形成实验检测肿瘤细胞单个细胞体外增殖能力；流式细胞技术检测细胞周期分布和细胞凋

6、亡情况；划痕实验和TraIlswen实验检测细胞迁移和侵袭能力；裸鼠原位成瘤实验观察各组细胞在裸鼠胰腺原位种植后成瘤及发生侵袭转移能力。(D利用荧光实时定量PcR技术和wbstemBlot方法检测转染后细胞EMT关键基因的mI玳A和蛋白水平的表达；⑤WestemBlot方法检测Wnt5a重组蛋白处理后Wnt5a信号通路相关蛋白的表达；CIAP进行去磷酸化处理。结果：①通过对134例胰腺癌组织芯片的wnt5a蛋白免疫组化染色发现胰腺癌癌旁组织中Wnt5a蛋白表达阳性率为16．4％；癌组织阳性率为81．3％；癌与癌旁组织中Wn

7、t5a蛋白表达的阳性率差异有统计学意义，P

8、示：与相应空载体组相比，两种胰腺癌细胞株过表达组增殖速度均加快，而干扰组则生长受抑制；平板克隆实验显示两种细胞的过表达组体外单个细胞克隆形成能力明显增强；PANC．1干扰组克隆形成能力降低，BXPC一3干扰组克隆形成能力与空载体组间无显著性差异。细胞周期实验显示过表达组及干扰组与相应空载体组之间周期分布