hedgehog信号通路与卵巢癌侵袭转移关系的实验研究

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1、摘要背景与目的：卵巢癌是世界范围内最致命的妇科恶性疾病之一，由于缺乏典型的临床症状、特异的体征及肿瘤标志物等有效的筛查手段，绝大多数卵巢癌病人在得到诊断时已处于晚期，使其死亡率高居妇科恶性肿瘤首位。肿瘤的转移能力有赖于细胞的迁移与侵袭，然而决定肿瘤转移能力的分子机制目前仍然不十分清楚。因此，努力探索调控卵巢癌细胞转移潜能的分子靶标将至关重要。Hedgehog(Hh)信号通路在细胞命运决定以及细胞增殖过程中发挥重要作用。该通路由Hh配体，膜受体Ptch和跨膜信号转导蛋白Smo以及参与Hh信号转导的胞浆蛋白复合体组成，其级联传导的末点被公认为锌

2、指转录因子Gli(Glioma-associatedoncogenetranscriptionfactors)，是该信号通路的关键节点，在信号转导中起枢纽作用。Hh靶基因涉及细胞增殖、细胞存活、细胞分化、细胞周期以及干细胞形成和细胞侵袭等多方面。有研究发现：卵巢癌中Hedgehog(Hh)信号通路异常活化，但信号通路异常活化与卵巢癌侵袭、转移的关系有待进一步明晰。本研究试图发现受Hh信号通路调控的靶基因，从临床标本、细胞及分子水平、动物模型等多个层次，采用细胞学、生物化学、分子生物学、生物信息学等多学科手段阐明受Hh信号通路调控的靶基因的作

3、用及分子机制，进一步揭示Hh信号通路与卵巢癌侵袭与转移的关系，为卵巢癌诊疗策略的选择及抗癌新药研发提供理论依据。方法：第一部分人上皮性卵巢癌组织中Hedgehog信号通路异常活化与临床病理特征的关系(1)为了证实在卵巢癌中存在Hh信号通路的异常活化，我们采用免疫组化技术检测了65例卵巢癌病人卵巢肿瘤组织石蜡切片中Hh信号通路重要组分蛋白Gli2的表达情况，并且在此基础上将Gli2的表达情况与卵巢癌的临床病理特征进行了相关性分析。摘要(2)同时，通过Western．blot及real．timePCR等方法检测卵巢癌及正常卵巢组织中Hh信号通路

4、重要组分蛋白Shh、Glil、Gli2等的蛋白水平及mRNA水平的表达情况。第二部分抑制Hedgehog信号通路降低卵巢癌细胞增殖与迁移能力(1)为了探索Hh信号通路与卵巢癌细胞增殖与迁移能力的关系，我们以卵巢癌细胞系(SKO．V3和ES．2)为研究对象，采用转录因子Gli特异性小分子抑制剂GANT61处理SKO—V3和ES．2细胞，对加药处理(实验组加30州GANT61，对照组加等体积的DMSO)的SKO．V3和ES．2细胞通过Western-blot、real-timePCR及免疫细胞化学方法在蛋白水平以及mRNA水平检测了Hh信号通路

5、中相关组分，如跨膜受体Smo，终末转录因子Glil和Gli2的表达情况。(2)加药处理(实验组加30uMGANT61，对照组加等体积的DMSO)后的SKO-V3和ES．2细胞，分别通过MTT比色法及BrdU增殖实验检测其细胞活力及增殖能力的变化。(3)加药处理(实验组加30州GANT61，对照组加等体积的DMSO)后的ES．2细胞，通过细胞划痕实验及软琼脂克隆形成实验检测其细胞迁移及克隆形成能力的变化。第三部分抑制Hedgehog信号通路改变卵巢癌细胞基因表达谱(1)为了研究抑制ml信号通路对卵巢癌细胞基因表达谱的影响，采用转录因子Gli特

6、异性小分子抑制剂GANT61(实验组加30pMGANT61，对照组加等体积的DMSO)，处理SKO．V3和ES．2细胞60llr，采用基因表达谱芯片技术分析其受Gli调控的差异表达基因，并对差异表达的基因进行GO(geneontology)pathway分析和KEGG(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)pathway分析，发现受Hh信号通路调控的靶基因。并采用real．timePCR和Westernblot分别对芯片发现的富集于某些信号通路的差异基因以及相关基因(如ITGB4、FAK、CD24、MMP7等

7、)在mRNA水平和蛋白水平进行验证，以确认芯片结果的可靠性。(2)用Gli特异性小分子抑制剂GANT61，转录因子Gli的siRNA(miR．Glil)摘要和含Hh配体的条件培养液(Shh．Med)分别抑制或激活Hh信号通路，采用real．timePCR、Westernblot以及细胞迁移实验研究Hh信号通路调控卵巢癌细胞的侵袭与转移的分子机制。第四部分抑制Hedgehog信号通路减慢卵巢癌生长为了在体内水平研究Hh信号通路对卵巢癌生长的影响，我们采用卵巢癌组织块皮下移植法构建荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型；并利用此动物模型，给予GANT61

8、(浓度10mg／ml，0．2ml／次)和同体积的溶剂对照处理，观测卵巢癌体积的变化，比较瘤体重量的改变；同时采用Westernblot技术检测瘤组织中Glil和Gli2的表达水平