神经营养因子artemin在胰腺癌侵袭转移中的作用

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1、第二军医大学博士学位论文神经营状因子Artemin在胰腺癌侵袭转移中的作用姓名：高莉申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：朱明华201205神经营养因子Artemin在胰腺癌侵袭转移中的作用摘要研究背景：胰腺癌的发病率逐年上升，早期诊断困难，进展迅速，预后极差。神经侵袭是胰腺癌较为独特的侵袭转移方式，涉及肿瘤细胞和神经之间的信号相互作用。胶质细胞源性神经营养因子(G1ialcellline．derivedneuro仃ophicfactor，GDNF)家族的四个成员及其相应的受体在胰腺癌中都有不同程度的表达。其中神经营养因子Anemin能够促进多种不同神经

2、的生存，并具有轴突导向作用；Artemin还在胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌等多种肿瘤中存在异常表达，影响这些肿瘤的致瘤性和侵袭力。研究目的：从细胞水平、组织水平和动物水平研究Anemin在胰腺癌生长侵袭中的作用，探讨靶向抑制Ane血n蛋白表达对胰腺癌的潜在治疗作用。研究方法：1用wrestenlblot法检测11例胰腺癌及配对癌旁组织、6株胰腺癌细胞株的Anemin蛋白表达情况；用组织芯片免疫组织化学(IHC)方法检测100例胰腺癌(60例导管腺癌、40例腺鳞癌)的Anemin蛋白表达，分析其与各临床病理学参数的关系；用生长相关蛋白(Gro叭hassoci

3、atedproteill43，GAP-43)IHC染色结合图像分析计数胰腺问质神经纤维的数量和面积，分析Anemill蛋白表达与胰腺癌间质神经纤维肥大增牛的关系。2．构建ArtemiIl真核表达质粒和4种RNA干扰(RNAi)质粒，用脂质体法转染PancI细胞，建立稳定转染Artemin过表达质粒和RNAi质粒的单克隆株，并利用W

4、estemblot法和qRT-PCR法筛选出过表达和RNAi效率最高的细胞株；用MTT法绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测各组细胞周期和AnnexmV法检测细胞凋亡，并通过克隆形成试验、划痕试验、Transwell小室基质胶侵袭实验等比较各

5、组细胞克隆形成、迁移、侵袭等生物学行为：收集Anemin过表达细胞和RNA干扰细胞的培养液上清，处理PCI2细胞，观察各组细胞生长和神经元样分化情况，比较各组癌细胞的神经营养活性。3．利用AnemiIl过表达和I矾A干扰的稳定转染细胞株，建立裸鼠原位移植瘤动物模型，观察成瘤组织的人体和显微镜下特点，比较各组肿瘤人小、周围器官侵犯、神经侵犯、脉管癌栓及淋巴结转移等情况；GAP一43IHC染色结合图像分析计数胰腺间质神经纤维的数量和面积，比较各组间质神经纤维肥大增牛的情况。第二军医大学博士学位论文结果：1．胰腺癌组织中的Anemill表达水平显著高于癌旁组织，6株胰腺癌细

6、胞株中都有不同程度的AnemiIl表达；免疫组化检测表明Anemin在胰腺癌组织中的阳性率(71．0％)显著高于癌旁组织(43．5％)，阳性定位于癌细胞、癌旁管状复合物、间质神经纤维及动脉壁；Anemin在癌组织中的表达与胰腺癌的组织病理类型、性别年龄、部位、大小、分化程度和周围器官侵犯等临床病理学参数无关，而与淋巴结转移和神经侵袭的发生有关；胰腺癌间质中可见明显的神经病理学改变，包括神经纤维肥大、增生及癌细胞侵犯神经。Anemin阳性组神经纤维的平均数量(49．72士5．177／cm2)和面积(0．328士0．058彻n2)均显著高于Artemin阴性组神经纤维平均

7、数量(28．72“．248／cm2)和面积(O．0857士0．025姗2)。2．在胰腺癌细胞中持续过表达AnemiIl增加了癌细胞克隆形成、细胞迁移、基质胶侵袭等能力，细胞培养上清能够诱导PCI2细胞的神经元样分化；l斟A干扰能够显著抑制癌细胞的克隆形成、迁移及侵袭力，细胞培养上清对PCI2的诱导分化作用也不明显；Anemin过表达或抑制对胰腺癌细胞生长曲线、细胞周期和细胞凋亡均无明显影响。3．Anemin过表达细胞与空载体对照相比，能够增加裸鼠原位移植肿瘤的大小，在体内能够促进癌细胞向周围器官侵袭，增加神经侵袭及脉管侵袭的几率，并促进癌旁神经纤维增生；AneminR

8、NAi组细胞成瘤率降低、肿瘤体积更小，侵袭周围器官的现象减少，神经纤维数量减少，也未见脉管癌栓、淋巴结转移及神经侵犯现象。结论；1．胰腺癌组织表达的Anemin蛋白参与了胰腺癌间质中神经肥大与增生等病理改变，并与癌细胞的淋巴结转移和神经侵袭的发生有关。2．胰腺癌细胞表达的Anemill在体外能够促进自身存活，增强癌细胞的迁移能力和侵袭力，并通过旁分泌作用产生了神经营养属性：觚emiIll矾Ai能够显著抑制这些作用。3．在胰腺癌细胞中强制表达Anemin蛋白能够增加原位移植瘤的体积，促进移植瘤向周围器官、脉管及神经侵袭，刺激间质神经纤维增生；靶向抑制A