nek2基因沉默对卵巢癌skov3细胞生物学行为的影响及其机制的初步研究

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1、重庆医科大学博士学位论文Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞生物学行为的影响及其机制的初步研究姓名：范婷婷申请学位级别：博士专业：妇产科学指导教师：唐良萏201205重庆医科大学博士研究生学位论文Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞生物学行为的影响及其机制的初步研究1摘要第一部分Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞生物学行为的影响目的设计合成有效的Nek2．siRNA，转染入卵巢癌SKOV3细胞，观察NEK2表达的变化及其对SKOV3细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭以及细胞周期的影响。方法1．采用免疫组织化学法检测Nek2在上皮性卵巢癌组织中的表达情况。2．采用化学合

2、成法，设计三条针对Nek2基因的siRNA，转染入卵巢癌SKOV3细胞48d,时后，分别采用Real．timeRT．PCR技术及Westernblotting技术检钡JJNek2基因和蛋白表达水平的变化，筛选出一条干扰效果最好的Neld．siRNA以进行后续实验。3．将Nek2．siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞后，采用MTT法检测SKOV3细胞增殖能力的变化；采用流式细胞技术检测SKOV3细胞凋亡和细胞周期的变化；采用Transwelld、室检测SKOV3细胞迁移及侵袭能力的变化。1基金项目：教育部博士点基金200806310001，重庆市卫生局重点项目2009．

3、1．59，重医大附一院重点项目YXJJ2009-05重庆医科大学博士研究生学位论文结果1．在上皮性卵巢癌组织中Nek2的表达水平明显增高。2．Nek2．siRNA转染SKOV3细胞48d,时后，与对照组相比，Nek2的mRNA水平和蛋白表达水平均显著降低(P<0．05)，其中干扰组2(NEK2．siRNA序列2)下降最为明显。空白对照组与阴性对照组相比，无统计学差异(尸>O．05)。3．通过对转染后484,时及72d',时的各组细胞进行MTT法检测发现：Nek2．siRNA干扰组细胞增殖能力显著低于空白对照组细胞和阴性对照组细胞，抑制率分别为32．1％，43．8％，(

4、尸

5、别为(351．3+14．2)、(360．7+11．1)、(95．74-6．2)，干扰组与对照组相比迁移细胞数明显下降(尸<0．05)。侵袭实验结果显示：空白对照组、阴性对照组和干扰组的穿膜细胞数分别为(340士17．3)、(329．3士13．6)、(27．3士5．1)，干扰组与对照组相比侵袭细胞数明显下降(尸

6、后不能顺利通过有丝分裂期，进入下一个细胞周期。3．Nek2可作为抑制卵巢癌转移和复发的重要靶点。关键词：．卵巢癌，Nek2，siRNA，增殖，凋亡，侵袭第二部分NEK2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞生物学行为影响的分子机制的初步研究目的初步研究Nek2．siRNA转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及其细胞周期影响的相关分子机制。方法1．Westernblotting技术检测Nek2-siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48小时后，与凋亡相关的因子Caspase．3、Bad及Bcl．2蛋白表达水平的变化。2．Westernblotting技术检ON,4Ne

7、k2一siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48小时后，与侵袭转移相关的因子MMP．2、MMP．9及TIMP．1蛋白表达水平的变化。3．Westernblotting技术检测Nek2一siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48小时后，与细胞周期相关的因子cyclinBl、CDKl及P27蛋白表重庆医科大学博士研究生学位论文达水平的变化。4．Westernblotting技术检测Nek2-siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48小时后，ERKl／2磷酸化水平的变化。结果1．Westernblotting技术检测结果表明：NEK2基因沉默后，与对照组相比，S