mir-10b靶基因hoxd10在肝癌细胞中的表达及侵袭功能影响

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文MiR．10b靶基因HOXDIO在肝癌细胞中的表达及侵袭功能影响TheExpressionofHOXDl0ofMiR-10btargetgeneinHCCandtheeffectofinvasionfunctioninHepG2课题来源：广东省科学技术研究基金专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员外科学论文评阅人闵军教授侯宝华教授2012年5月17日广州硕士学位论文mirl0b革E基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及侵袭功能影响摘要背景肝癌是我国常见消化

2、道肿瘤，发病率高，手术复发机率大、预后差，其中绝大多数是为肝细胞癌，影响预后因素与肝癌细胞生物特性有密切关系。传统的组织病理学诊断方法有局限性，如现在利用肿瘤相关标志物如甲胎蛋白已经用于临床诊断、早期复发与预后，但存在一定假阴性和假阳性发生率，为能较好提供肝癌早期诊断及复发依据，从肿瘤基因方面进行肝癌早期诊断及肝痛转移研究意义重大。许多关于微dxRNA(miRNA)和肝痛相关基因方面的研究表明12】，某些微小I埘A在肝癌中通过表达上调起促癌基因作用，另外一些微小RNA又可以表达下调起抑癌基因作用，其机理

3、可能是微小RNA对其靶基mRNA通过反向调控作用，分别在转录和翻译水平调控靶基因。肝癌细胞系有多种，从肝癌组织提取后经过培养传代过程，不改变其生物学性质。根据研究设计目的，选取不同的细胞系，再用人工方法将基因转染到病毒或质粒中，从而建立既有特定生物学特性又含有目的基因的肝癌细胞系【3l。本研究采用肝癌细胞株SMMC．7721，特点是有较高的异体移植成功率，Huh7能检测至UHBSAg，HepG2不含HBV，根据实验目的从这三种肝痛细胞目标基因表达水平量不同，选取符合要求的肝癌细胞。MiR．10b位于同源

4、盒子基因HOXDl0簇巾间染色体2q31上，HOXD4与13附近，最初报道miR．10b在胶质瘤组织表达上调，在乳腺癌方面的研究逐渐增多，发现人和小鼠乳腺痈巾高度表达，并且促进调控肿瘤细胞转移和侵袭，另一方面在非转移乳腺肿瘤细胞过表达miR．10b，可以抑制肿瘤细胞侵袭和转移促发机制，miR．10抑制了乳腺肿瘤细胞HOXDl0的蛋白质翻译过程，导致增加具有亲摘要转移RHoC基因表达，近来，发现miR-10b在肝癌恶性肿瘤组织与肝脏非肿瘤组织比较miR一10b呈高表达。这些结果说明存在调控肿瘤细胞侵袭和转

5、移通过miR-10b特异性的旁路【4】。肿瘤转移及侵袭原因与miR-10b的关系密切，如与乳腺癌、胰腺癌、血液系统肿瘤、食道痛中都有异常表达，表达水平差异，可能与其靶基因受到调控作用机制不同有关。miR．10b的靶基因有许多，相互作用关系目前还不是很清楚，HOXDl0基因是其中一种，根据相关文献报道该基因与多种肿瘤发生有关系密切。本研究关注的是mirR一10b与其可能靶基因HOXDl0在肝痛细胞巾表达情况和该基因部分功能。基因HOXDl0同样位于2号染色体，是细胞分化、个体发育生长的关键基因位点【5】。

6、HOXDl0属于同源盒子家族其中一种，HOXDl0基因与肿瘤的关系研究，目前处于初步阶段，主要涉及乳腺癌、血液病、食道痘、胶质瘤方面的研究。关于肝癌与miR-10b的靶基因HOXDl0关系，目前少见相关文献报道，本实验对三利·肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC2751J用SYBRGREEN实时荧光定量PCR方法来检测HOXDl0mRNA表达的方法，并分析HOXDl0基因在肝痛细胞Huh7、HepG2、SMMC27巾的表达情况。依据聚合酶链反应机理，实验反应中荧光发出信号会发生变化，并可以绘制成对应

7、的曲线，来测定PCR生成物的量，得出曲线与标准曲线做分析，得到的未知样品最小循环数值(CT)。目前荧光检出方法有荧光荧光探针法和嵌合法。该实验采用荧光嵌合法，通过对荧光强度的检测，来检测目的基因PCR扩增产物量。采取标准曲线相对定量法，进行相关基因功能方面研究，同时为了校正不同样本间RNA质量和逆转录效率的不同，18srRNA基因及U6作看家基因，来比较样品中目的基因表达量。PCR反应的专一性可通过标准曲线分析出来：如果溶解曲线是单一峰型说明生成产物符合要求，出现两个以上峰型，说明有其他引物生成16l。

8、在本实验巾，我们通过对溶解曲线分析推断扩增目的产物特异性。研究细胞基因功能的主要方法，是将外源性分子遗传物质转入真核细胞内，¨硕士学位论文分为两种：瞬时转染外源遗传物质不整合到宿主染色体内，可以产生表达量高，持续时间短，需要在转染后24．72小时内分析结果。稳定转染是外源遗传物质整合到宿主染色体内【．71。本实验采用脂质体瞬时转染法，因为该方法适用细胞广、高转染效率，可重复性。细胞侵袭实验为在特殊培养基中建立模性结构，该膜结构与细胞基底膜类