hedgehog信号通路在人牙周膜干细胞应力成骨过程中调控作用的探索性研究

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1、第三军医大学硕士学位论文Hedgehog信号通路在人牙周膜干细胞应力成骨过程中调控作用的探索性研究姓名：常慧君申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：周继祥201205Hedgehog信号通路在人牙周膜干细胞应力成骨过程中调控作用的探索性研究摘要正畸临床中对牙齿施加合适的正畸力后，围绕牙根的牙槽骨和牙周膜将发生适应性改变，进而牙齿将发生位置的移动。牙齿移动过程中张力侧主要是成骨过程而压力侧主要是骨吸收过程，两侧平衡协调共同作用而使牙齿发生预期的移动。在张力侧以成骨活动为主的骨改建过程中，牙周膜组织

2、发挥了重要的介导作用。通过体内外研究，现在已经证实正畸力的刺激通过胞外基质传导至胞浆内，引起一系列细胞因子的合成，包括细胞因子、生长因子、酶类以及结构分子类的表达和合成，并参与了细胞的分化、增殖以及功能的变化，如前列腺素类(PGs)、环单磷酸腺苷(cAMP)、肌醇磷酸类、钙离子通道、分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路等信号参与了人牙周膜细胞的成骨分化过程。而细胞在机械应力作用下成骨过程并非只是启动某一个的信号通路，而是多种通路在时空顺序上的协同作用。但这个成骨过程的具体机制目前并不明了。早期研究表明：H

3、edgehog(Hh)信号通路对多种动物以及人体组织和器官的形态发生有着至关重要的调控作用，对成体组织的功能稳定和干细胞的增生分化也有促进作用。但在脊椎动物和果蝇间，Hh信号通路总体的作用机制和大多数的关键信号通路因子是保守的。近期研究表明：在脊椎动物中，Hh蛋白有三种同源体，Sonichedgehog(Shh)，Indianhedgehog(Ihh)，Deserthedgehog(Dhh)，而其中的Shh和Ihh与成骨分化关系密切。有学者发现Hh信号通路在间充质细胞的成骨化过程中发挥了积极的调控作用。

4、本课题组在前期工作中，不仅成功分离获取了人牙周膜干细胞(humanperiodontalligamentstemcells，PDLSC)，还经实验证实，PDLSC在动态张应力作用下向成骨细胞分化，但调控机制不明。鉴于Shh和Ihh与多样细胞的成骨作用有着密切关系，我们推测Hh信号通路可能在PDLSC应力成骨细胞分化过程中发挥了作用，并据此设计了本实验，首先初步探明PDLSC在应力成骨的同时，Hh信号通路被激活；再通过激动剂purmorphamine和抑制剂cyclopamine调控Hh信号通路的活性，借

5、以佐证Hh信号通路对PDLSC应力成骨的调控作用，以期从分子水平探讨矫治性牙位移动的发生第三军医大学硕士学位论文———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一一机制，为深入研究矫治性牙位移动机理建立一个全新的实验研究模型。目的：利用体外分离培养的PDLSC，并经细胞应力实验证实Hh信号通路对PDLSC应力成骨的调控作用，探索PDLSC的应力成骨调控机制。方法1人牙周膜干细胞的

6、分离、培养及鉴定在西南医院口腔科取12～24岁间因正畸需要而拔除的健康前磨牙或阻生的第三磨牙，牙周牙体及全身状况均健康，并经知情同意。刮取牙根中三分之一的牙周膜组织，经I型胶原酶消化40分钟，离心收集后种于6孔板原代培养。获得牙周膜细胞后，通过改良法克隆化培养得到PDLSC，经测定细胞克隆形成率、免疫荧光检测角蛋白及波形蛋白、流式细胞术分析细胞表面标志物STRO—l和CDl46以及成骨、成脂诱导分化实验进行干细胞特性的鉴定，为PDLSC应力成骨实验和Hh信号通路效应蛋白的检测作准备。2动态张应力下人牙周

7、膜干细胞成骨过程中Hh通路的检测为了解PDLSC应力成骨过程中，Hh信号通路的活性状况。本研究取第4-6代PDLSC种于BioFlex专用加载六孔培养板(孔底为硅胶膜)P4，在矿化诱导环境下运用国际标准化水准的FX一4000T加载系统进行动态张应力加载，方式为最大形变12％、最小形变为。的正弦波，频率为0．1Hz(5S拉抻5S放松)张应力，作用时间24h，对照组的BioFlex板静置培养不加力；以实时荧光定量聚合酶链反应(real．timePCR)监测动态张应力作用下，PDLSC成骨标志物Runx2、A

8、LP的mRNA的合成与表达的改变；以及Hh信号通路关键效应蛋白GLll、PTCHl、SMO的mRNA的合成与表达的改变。3purmorphamine对人牙周膜干细胞应力成骨的影响为证实Hh信号通路对PDLSC应力成骨的正向调控作用，本实验取第4-6代PDLSC种于BioFlex专用加载六孔培养板，在矿化诱导环境下加入不同浓度的purmorphamine(1lxM，2“M，4pM)，加载最大形变为12％、最小形变为0的正弦波，频率为0．1Hz