甲状腺乳头状癌mir―34b基因表达和其启动子区甲基化临床意义探究

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1、甲状腺乳头状癌miR—34b基因表达和其启动子区甲基化临床意义探究【摘要】目的：探讨miR-34b基因表达及其启动子区甲基化（MSP）在甲状腺乳头状癌（PTC）中的临床意义。方法：收集2008年10月-2013年1月本院治疗的42例甲状腺乳头状癌患者癌组织标本（实验组）和42例甲状腺腺瘤患者瘤旁组织标本（对照组），检测两组miR-34bmRNA表达（实时定量PCR法）及miR-34b基因启动子区甲基化（甲基化特异性PCR法），并对结果进行分析。结果：实验组miR-34bmRNA相对平均表达量（0.84±0.04）,miR-34b基因启动子甲基化阳性率71.4%,与对照组比

2、较，差异有统计学意义（P0.05）；而存在淋巴结转移甲基化率（88.5%）显著高于不存在淋巴结转移（43.8%）,差异有统计学意义（P2cm共23例；TNM分期结果：I期20例，II期7例，III期12例，IV期3例；发生包膜浸润14例，未发生包膜浸润28例；存在淋巴结转移26例，无淋巴结转移16例。对照组中男17例，女25例；年龄24〜73岁，平均（48.3±6.4）岁，W50岁21例，50岁以上21例；所有标本均经组织病理学检查明确诊断，所有标本在离体10min内完成取材，置于液氮内放入-80°C冰箱内进行保存。本实验患者均签署知情同意书。1.2实验方法1.2.1实验

3、试剂及仪器美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂盒及ABI7900HTPCR仪，日本TAK-ARA公司生产的逆转录试剂盒，上海吉玛公司生产RT-PCR试剂盒，由上海英骏生物工程公司所合成的PCR引物序列，美国ZYMORESEARCH生物科技公司销售的EZDNAMethylationTM-GOLDKit试剂盒。美国赛默飞世尔科技公司生产的Forma88000超低温冰箱，德国艾本德公司生产的Centr辻uge5810R高速离心机，PowerpacHC电泳仪（美国BIO-RAD公司），美国Thermo公司制造的NAN0DR0P1000紫外分光光度计，凝胶成像仪及凝胶

4、数字成像系统（美国UVP公司）。1.2.2提取组织RNA液氮研磨法：研磨新鲜组织成粉末状，滴加Trizol试剂进行混合，参照Trizol试剂盒说明书对组织总RNA进行提取。成功提取后用紫外分光光度计（光密度值260/280）对RNA纯度进行检测，总RNA在1.8〜2.0之间，保存于-80匸超低温冰箱中备用。1.2.3检测miR-34bmRNA表达RT-PCR法:参照miRNAsRT-PCR试剂盒以及逆转录试剂盒中所附说明书进行操作，cDNA通过试剂盒内的通用逆转录引物进行合成。反应体系：Primer.脱氧核糖核昔三磷酸Mixture及RNA均为1uL,ddH20为7uL；

5、反应条件：42°C中作用60min后72°C中作用10mino以cDNA为模板扩增PCR,反应体系:10.0uLPCRMix,0.4uLmiR-34b引物，2.0uLcDNA,0.2uLTaqDNA多聚酶，7.4nLddH20；反应条件：95°C内3min预变性；95I中作用12s,60°C中作用60s,共循环40次。内参照为B-肌动蛋白mRNA。1.2.4检测甲基化特异性PCR法检测：酚氯仿抽提法提取MSP组织DNAoEZDNAMethylationTM-GOLDKit试剂盒修饰及纯化甲基化基因组DNA。甲基化条件：15min95°C,30s95°C,30s54°C,4

6、0s72°C,循环35次；非甲基化条件：15min95°C,30s95°C,30s58°C,40s72°C,循环35次。紫外线下观察分析PCR凝胶电泳情况(1%琼脂糖)。甲基化引物序列片段长度为128bp,上游5-ATTCGTTTCGTTTCGCGTTCGTTTC-3,下游5-CTAAAACTAACTCTCTCGACCCCG-3。1.3观察指标参照文献［4］应用2-AACT法计算miR-34bmRNA的相对平均表达量，分析甲基化与临床病理的关系。1.4统计学处理应用SPSS14.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用非配对t检验，组内比较采用配

7、对t检验，计数资料采用字2检验,P