实验三-大肠杆菌感受态细胞制备(新)

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1、实验三大肠杆菌感受态细胞的制备【课前预习】1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？【目的要求】1、了解感受态细胞生理特性及制备条件；2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法；【基本原理】所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制

2、备感受态细胞和进行成功转化的关键。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0°C、CaCl2低渗溶液屮，细胞膨胀形成球状，转化混合物屮的DNA形成抗DNase的耗基■钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖，重组质粒在转化的细菌屮，

3、表达目的基因，因而在选择性培养基平板屮，可以选出阳性细菌转化子。Ca?+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小,转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。CaCl2转化法的优点是：简单快速，重复性好，菌株适用范围广。另外，电击法也可用于转化过程，电击法不碍要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，利用瞬时高压电流(数千伏特)处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部，转化率最高达1()9-10")转化子/pg闭

4、环DNAo制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或・7()°C保存(有效期6个月）。50-100mmol/L

5、■CaCL:受体细菌il©I菌重组体转入细菌0.1mol/LCaCI2受态细胞o°c重组体0【实验用品】（一）仪器与器皿恒温振荡器、分光光度计、电动沉淀离心机、旋涡混合器、恒温培养箱隔、电热恒温、水浴锅、恒温摇床、普通冰箱、Eppendorf管、转液管、平皿、涂布棒、微量取样器、微波炉、三角烧瓶、试管、刻度离心管、保温瓶、酒精灯等。（二）菌种大肠杆菌DH5a（rk'mk'rec'）（三）培养基与试剂1、LB液体培养基

6、（1%蛋白腺、0.5%酵母粉和0.5%NaCl,pH7.5。）2、100mmol/LCaCl2溶液3、氨节青霉素溶液（50亳克/毫升）4、CaCl2-MgCl2（80mmol/lMgCl2,20mmo/lCaCl2）溶液配制:储存液配制：5MCaCI2配制：CaCl2・2H?O36.75g-50mL比0,37°C孵箱中放置过夜使Z完全溶解，用除菌滤器过滤除菌；2MMgCl2配制：MgCl2・6比020.3g-*50mLH2O,高压灭菌。工作液配制：0」MCaCl2-MgCl2配制：10ml:5MCaCl240ul+2MMgCl2400ul+H2O

7、9.56ml【方法步骤】（一）大肠杆菌感受态细胞制备1、将大肠杆菌DH5a接种于LB平板上活化，置于恒温培养箱中37°C培养过夜。2、挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落接种于一只装有5毫升LB液体培养基的灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。3、转移0.5毫升过夜培养物于一只装有50毫升LB培养基（接种量按菌液浓度而定，一般在1%左右）的灭菌三角瓶中，37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。4、取1毫升培养液以未接种的LB作空白对照，在分光光度计上测ODooo的光密度值，约为0.2-0.5左右。5、无菌条件下将上述1毫升菌液倒

8、入1.5毫升EP离心管中（离心管应带盖并高压灭菌过）,每组2支。室温下，4000rpm离心5分钟收集对数期细胞，弃培养基，保留细胞沉淀。6、加入预冷的lOOmmol/LCaC—MgCb溶液（80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2）600微升，用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体，使其悬浮后，把2支管转为1支，摇匀后于冰浴中放置30分钟。7、4°C下，4000rpm离心10分钟收集细胞；弃MgCl2-CaCl2溶液，保留细胞沉淀。8、再把菌体悬浮在200微升lOOmmol/LCaCb的溶液屮，并轻微打匀，冰浴放置2小时。此时，可以将制备

9、的细胞直接转化，也可以将细胞放置在4°C冰箱中，于l・7d内使用;也可以向细胞液中加入甘油，至甘油终浓度为10%,・70°C长期保存。注