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《tss法制备大肠杆菌感受态细胞》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、TSS法制备感受态1.取感受态种子接种于含有LB的2ml试管中，37度振荡培养2.将上述培养液用LB按1：100500微升菌液加到50毫升LB液体培养基当中。稀释后，37度振荡约3h（OD为0.5±0.03）3.把培养物放在冰上冷却后，2500rpm4度离心10min，收集菌体，弃上清4.使用前准备好1XTSS(10%W/VPEG3350,50mMMgCl2,85%LB)5.将收集到的菌体重悬于1XTSS（每100ml培养物溶解于10ml的1XTSS）,混匀。注意保持冰上操作6.用1.5mlEP管冰上分装，100μL/管，先放在液
2、氮中速冻一下，后放于-70保存20ml1xTSS：LB19mlMgCl2·6H2O0.2033gPEG33501.9g将LB和PEG3350混合后过滤（0.22）除菌加DMSO1ml用前冰浴，4度保存TSS方法制备感受态细菌（一步法制备感受态细菌）TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、 准备工作1、 缓冲液1×TSS的配制：事先配制1M的氯化镁——20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。取干净的100ml量筒和100ml烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1g蛋白胨，0.
3、5g酵母抽提物，0.5g氯化钠，10gPEG(MW=3350),5mlDMSO，5ml的1M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um滤器过滤除菌。储存在4度，保质期约6个月。2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种——Dh5α，用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶，分别装有30ml和50mlLB，灭菌后置于4℃冰箱备用。3、 若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种。其余做转化用。二、 感受态制备程序：1、前一天晚上调单菌落至30mlLB中过夜培养（12-16
4、h）,按1：100比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到新鲜的50mlLB培养液中，于37℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40～50min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min，弃上清，收获细菌。加入原体积十分之一（这里为5ml）的1×TSS液(冰预冷)悬浮细胞，然后分装成100ul/份，全部冰上操作，－80度保存。三、 转化时取一管（100ul）感受态细菌，（冻寸细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入3-5ulDNA（0.1～100ng），轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖
5、的LB培养液，37度150r/min温和振荡培养60min，涂布，室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养（17-20h）。制备高效率感受态的方法BIOX.CN2005-4-1523:40:00来源：丁香园 液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLIDH5,JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个,接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基.培养基量不可再多,会影响效率.在18度150-250RPM培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温
6、,但不可高于37度.OD600约0.4-0.8时停止培养,放在冰水中冷却10分钟4度,300RPM离心15分钟,回收菌体去掉上清后,用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮,在冷10分钟再次离心回收菌体用1/12.5体积的TB悬浮,添加最终浓度为7%的DMSO,再冷却10分钟0.1-1毫升分装,直接在液氮中冻上.在液氮或-80度保存.TB溶液*TRANSFORMATIONBUFFERPIPES3.0G10mMCaCl2.2H2O2.2g15mMKCl18.6g250mMaddwaterupto950ml用5NKOH调PH至6.7-6.8*低
7、PH不溶在加终浓度未55mM的MnCl2.4H2O10.9g定溶到1升,过滤灭菌,4度保存.但有人提出,冻存后转化效率降低,且这种方法不适合大质粒.【zihudie】（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。（4）用预冷的TBBuffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。（5）重复第4步操作。（6
8、）用8mL预冷的TBBuffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7%。（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。本法效率极高,建议大家采纳【yog】1.单菌落-------2mlLB37度120RPM过夜------1%转接-------37度2
