和厚朴酚对念珠菌的体外抗菌活性及机制初探

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1、和厚朴酚对念珠菌的体外抗菌活性及机制初探张莉敏1张传涛2(四川成都中医药大学附属医院610073)【摘要】目的了解和厚朴酚(Honokiol,HNK)对白念珠菌的体外抗菌活性；初步探讨其作用机制。方法临床分离的念珠菌24株，前期药敏实验证实对氟康哇耐药，采用微量稀释法微量稀释法(NCCLS-M27A)检测HNK体外抗菌活性;并以白念珠菌耐药标准菌株ATCC64550为研究对象，设为空白组、实验组，实验组给予50μg/ml浓度的HNK,共培养24小时后在透射电镜下观察念珠菌细胞形态结构变化。结果HNK体外对氟康哇耐药念珠菌有抑菌作用，

2、其MIC(minimalinhibitoryconcentration)范围为12.5〜100μg/ml0HNK作用后真菌细胞变形，部分细胞膜不完整，内容物外露，近细胞壁处有较大面积低电子密度区，细胞质内有小空泡产生。结论HNK对念珠菌体外具抑菌作用，可能是通过作用于细胞壁而实现。【关键词】和厚朴酚念珠菌微量稀释法机制【中图分类号】R285【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2013)19-0134-02念珠菌引起的真菌感染的发牛率及病死率正持续上升⑴，临床常用抗真菌药物治疗周期长、价高、抗菌谱窄、药物毒性大、三卩坐类药

3、物耐药以及患者耐受性差等问题⑵。HNK是中药材厚朴中提取的有效单体活性成份，因发现其有抗肿瘤作用［3・5］而成为近年来的硏究热点，研究认为其有一定抗细菌作用。但有对抗真菌作用研究不多。我们试图釆用国际公认的NCCLS-M27方案来研究HNK体外对耐药念珠菌敏感活性，并探索其可能的作用机制。1材料和方法1.1材料1.1.1实验菌株和质控菌株：均来自四川大学华西医院实验医学科微生物室；24株实验白念珠菌来源于临床送检标木，标准质控菌株为白念珠菌耐药株ATCC64550；经形态学及念珠菌显色培养基鉴定到种，前期药敏试验证实对氟康卩坐耐药。分离纯

4、化的菌种用制备好的甘油肉汤保存于・20°C冰箱，试验前将菌株在沙保罗弱培养基上划板接种，35°C孵箱培养24ho1.1.2实验药品、试剂及设备：HNK化学对照品（纯度100%,四川省药检所）;96孔细胞培养板（Cosmo）；超净台（中国苏清AiRTECH;VS-1300型）；日立H-600IV型透射电镜等。1.2方法1.2.1HNK对24株临床分株念珠菌的体外药敏试验采用NCCLS推荐的微量液体稀释法［6］。将制备好的抗真菌药物母液用RPMI1640液体培养基做稀释液进行倍比稀释。HNK的各级浓度分别为800〜3.1μg/ml.^种

5、后终浓度分别为400-1.55μg/ml,同吋保证DMSO的最终接种浓度低于1%。将各级倍比稀释后的抗真菌药物液加入96孔细胞培养板中，从每排第1至第10孔分别加入经过倍比稀释的浓度依次降低的药液各100μL第11孔加入RPMI1640液100μl,作为阳性生长对照孔，第12孔为阴性对照孔，加入RPMI1640培养液200μlo每次配制药敏板的同吋均制备一块质控药敏板，微量稀释药敏板保存于一70°C冰箱。经两次35°C培养24h的试验念珠菌株，取5个直径大于1mm的菌落用0.85%的无菌盐水制成菌悬液，震荡15秒，

6、并用分光光度计调整其浊度，酵母菌浊度均为0.5麦氏标准浊度（相当于1×106〜5×106CFU/ml）,以RPMI1640液体培养基稀释1000倍至最终浓度为1〜5×103CFU/ml（作用浓度为0.5〜l×103CFU/ml）o将冷冻的药敏板按在4°C、室温下各放置lh的程序融化，然后置于超净工作台上，用移液器分别加100μl配制好的菌悬液于每排第1至11孔中。将接种好菌液的药敏板置于温盒内，然后置于35°C孵箱内静置培养24小吋。1.2.1.1最低抑菌浓度的判定每孔的生长情况与阳性

7、对照孔作比较并按以下尺度评分：0：完全透明；1：雾状混浊；2.浊度明显降低（与生长对照孔相比超过80%生长抑制）；3.浊度轻度下降；4.浊度未降低。与生长对照孔相比超过80%生长抑制所对应的最低药物浓度为HNK药物的MIC值。1.2.1.2设置对照每次试验均设置对照，对白色念珠菌敏感株ATCC64548和耐药菌株ATCC64550分次进行反复测定，只有当其MIC值介于其质控范围内之吋，生长对照孔生长良好，并且其他孔有随着药物浓度升高则菌的生长梯度受抑制时方证明实验成功。1.2.2透射电镜标本的制备与观察将HNK50μg/ml浓度组的

8、培养液移于无菌管中，在4°C高速离心机中离心1500转/分离心15分钟，吸弃上清液后用0.5%戊二醛沿管壁缓慢滴入，在4°C冰箱内静置30分钟后，再次在4°C以12000转/分离心15分钟，弃